miércoles, 25 de abril de 2012

2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO

20/04/12
2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO

En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante.
crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.
las plántulas recién enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso

Mediante aclimatizacion (endurecimiento) entre 4-8 semanas
Paulatina y secuencialmente
1.       Se controla la luz desde el 20% hasta el 100%
2.       Sustrato en las 2 p´rimeras semanas riega ms 25%
3.       Hr se mantiene desde 100 normal
4.       Se mantiene con nebulización
5.       Normal se cortan las raíces de las plantas in vitro .
li

ll
li
j   literatura citada
    www.biotecnologia.culitivo de tejidos vegetales.com

martes, 24 de abril de 2012

2.3.6 CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE

19/04/12
2.3.6 CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE


cambios fisiológicos o sensibilidad, que se expresa como una cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con esterada frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales.
La variabilidad fisiológica en los cultivos de células vegetales es la más fácil de aplicar, debido a la rápida reversibilidad del cambio producido. 


 Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.

Los cambios fisiológicos también dependen la adaptación al medio ambiente, ya que implica la humedad relativa y es de un 70%, esto lleva a la evaporación y transpiración de agua en la planta, función que realizan (epidermis, parénquima y estomas) esto para la regulación del agua tanto entrada como salida; cuando se presenta calor y aire o viento seco es menos viable la adaptación de la planta al sustrato y principalmente al medio.

literatura citada
www.lamolina.edu.pe/agronomia/dhorticultura/html/.../chau.doc

2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACION

18/04/12

2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACION

Para las condiciones ambientales de incubación es conveniente que los cultivos sean incubados en ambientes controlados, en lo que se refiere a la luz y a la temperatura, etc.

Se menciona que para que una planta crezca naturalmente necesita de 5,000 a 8,000 Lux, para un cultivo de tejido vegetal y se necesita 2,000 a 2,500 Lux la cual es una cierta medida de luz natural; por el cual se establece una temperatura de 18-25°C.

Por otro lado la fase gaseosa es nula o es muy poca, ya que la concentración de CO2 al medio ambiente debe ser de 0.03%.

La humedad relativa es la que se encuentra dentro del frasco, presentándose en pequeñas gotas adheridas en la pared del mismo, y representa el 100% de la humedad. Cabe mencionar que la humedad in vitro es diferente a la del ambiente natural.

En ocasiones se puede presentar un fenómeno llamado vitrificación este se presenta con el hinchamiento por el exceso de agua en el explante de la planta, y es cuando los tejidos se han sometido en una humedad no factible para los explantes y requiere de una regulación.

Con el paso del tiempo los explantes en subcultivo pierden el poder vegetativo (mutación) y aumenta las mutaciones (variación somaclonal).

literatura citada
www.inia.gob.pe/boletin/BCIT/.../cultivos_de_tejidos_in_vitro.htm

domingo, 22 de abril de 2012

2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE

18/04/12
2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas . El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante  y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo  

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.



literatura citada
http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html

miércoles, 18 de abril de 2012

2.3.3 EXPLANTE

16/03/12
2.3.3 EXPLANTE

Tejido removido de un organismo y transferido para su crecimiento a un medio artificial de nutrientes
La elección de un Explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, dicha elección en parte está determinada por el objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada.
El tamaño del Explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el establecimiento de los cultivos; cuanto más grande sea, mayores son las posibilidades de obtener proliferación callosa; existe un tamaño mínimo para la proliferación, el efecto del tamaño del Explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene; su importancia ha sido señalada en cultivos de meristemos, anteras, suspensiones celulares, embriones y protoplastos.



literatura citada
http://biotec-esp2011.blogspot.mx/2011/11/establecimiento-de-cultivos-de-tejidos.html

2.3.2 SELECCION DE PLANTAS MADRES

16/03/12
2.3.2 SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES


La selección de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idénticas al progenitor (propagación asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sería deseable conocer el virus especifico presente, pues así las condiciones de cultivo varían, aplicándose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos.

El tamaño del inóculo también es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de diámetro, y ápices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de diámetro; generalmente el número de plántulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamaño del meristemo o ápice cultivado.

Por último, es importante señalar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en él juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, específicos de la especie que estemos cultivando; éstos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales.

literatura citada
http://www.monografias.com/trabajos12/aplicult/aplicult.shtml

2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

12/03/12
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación:
Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto
Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir alos brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos, asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz.

literatura citada
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales

2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

09/03/12
2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro es una técnica de la Biotecnología que comprende al conjunto de técnicas que permiten la manipulación biológica de células u órganos vivos, con fines de mejoramiento genético, desarrollo de productos medicinales, investigación científica entre otros.
Se afirma que la técnica de cultivo de tejidos vegetales se originó en el siglo pasado con el reporte del cultivo indefinido de tejidos vegetales de zanahoria (Daucus carota L.) y tabaco (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii L.) ambos se lograron simultáneamente, por primera vez, en 1939 en Francia por Gautheret y Nobecourt y en Una plántula del árbol de hule (Hevea brasiliensis Müll.) desarrollándose en un cultivo in vitro. (Foto CIRAD Francia) EE UU por White. Ambos grupos de investigación describieron por primera vez la inducción de tejido desdiferenciado (tumores y callos) en estos cultivos y su subsecuente diferenciación en nuevas plantas. C ello se tuvo por primera vez la capacidad para manipular y potenciar o exacerbar la capacidad multiplicativa de los vegetales bajo condiciones de laboratorio y sin pasar por procesos sexuales, proceso al que se le denominó multiplicación in vitro.
El cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal) se cultiva asépticamente en un medio de composición químicamente definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.

literatura citada
http://biotec-esp2011.blogspot.mx/2011/11/establecimiento-de-cultivos-de-tejidos.html

martes, 17 de abril de 2012

practica subcultivo (siembra de material ya establecido in-vitro)

25/03/12
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

BIOTECNOLOGIA APLICADA EN LA BIOLOGÍA


SUBCULTIVO (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN-VITRO)

QUE PRESENTA:

ALFREDO ORTIZ MARTÍNEZ

YOLANDA E. MORENO HERNÁNDEZ

HELMER MARTÍNEZ CASARRUBIAS

MA. ALEYDA LÓPEZ HARRISON

ELIDENE PÉREZ QUINTANA

LAURA ORTEGA TORRES

LIC. BIOLOGÍA

CD. ALTAMIRANO, GUERRERO. MÉXICO. MARZO  23  DEL 2012

AGRADECIMIENTOS

A dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de nuestros propósitos con respecto a nuestra carrera, ya que en momentos difíciles siempre está para apoyarnos cuando más lo necesitamos.

A nuestros padres ya que sin su apoyo incondicional no estaríamos ahora estudiando una licenciatura y la manera de animarnos a seguir estudiando para tener un futuro mejor.

A nuestros hermanos que, siempre están allí en las buenas y malas para ayudarnos y darnos ánimos de seguir luchando y seguir adelante para cumplir con cada uno de nuestros objetivos.
A los que integran este equipo: Alfredo, Yolanda, Helmer, Ma. Aleyda y Elidene, Laura ya que sin la unión y el trabajo en equipo de llevar a cabo esta práctica seria más tedioso el realizar dicha práctica.

A  nuestra escuela el IT de Cd Altamirano por facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno de los procedimientos de investigación y aprendizaje que se requieren en dicha asignatura, así como el material y equipo de laboratorio que se utiliza en el transcurso de cada práctica.

Al M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro motor de aprendizaje ya que sin su apoyo, la práctica sería muy difícil de llevarla a cabo.

RESUMEN

La presente práctica tuvo como objetivos el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo y la asimilación de habilidades en la siembra. Usualmente el cultivo de tejidos in vitro consiste en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial de regenerar una planta nueva. Dentro de los puntos básicos importantes para llevar a cabo dicha práctica para obtener resultados factibles fueron los siguientes: se lavaron los explantes con agua estéril y cloralex para desinfestar y así obtener explantes limpios de microorganismos que pudiesen contaminar el medio de cultivo así como el explante, se esterilizó a flama los materiales a utilizar para el sembrado con el fin de eliminar la presencia de microorganismos, cabe mencionar que la esterilización formó parte central de la práctica pues se tuvo que tener las condiciones de asepsia para evitar al máximo la propagación de microorganismos no deseados.

ABSTRACT
This practice aimed to proper handling of plant material flow chamber and the assimilation of skills in planting. Usually the in vitro tissue culture is to isolate a portion of the plant (explant) and artificially provide physical and chemical conditions appropriate for the cells to express their potential to regenerate a new plant. Among the important points to carry out this practice to obtain feasible results were as follows: the explants were washed with sterile water and Cloralex to disinfect and clean obtain explants of microorganisms that might contaminate the culture medium and the explant a flame sterilized materials to be used for seeding in order to eliminate the presence of microorganisms, it is noteworthy that the central sterilization formed practice because it had to be aseptic conditions in order to minimize the spread of microorganisms desired.
ÍNDICE
                                              
I.              Antecedentes…………………………………………………….. 5 - 6

II.            Definición del problema………………………………………….7


III.           Objetivos…………………………………………………………...8
3.1  General
3.2  Especifico

IV.          Justificación………………………………………………………..9

V.           Fundamento teórico………………………………………………10 - 12


VI.          Materiales y métodos……………………………………………..13

VII.         Resultados………………………………………………………....14 - 18


VIII.       Conclusiones y recomendaciones……………………………....19

IX.          Fuentes consultadas……………………………………………...20


I. ANTECEDENTES
La historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales se remonta a unos 200 años, con la "Teoría de la Totipotencia" formulada por Schwann y Schleiden (1838). A partir de esta teoría nació el cultivo de tejidos y células vegetales. Un siglo después, Nobécourt, Gautheret y White (1939) consiguieron el primer cultivo de tejidos vegetales auténtico in vitro. A partir de ése entonces y con los descubrimientos de las fitohormonas auxina y citoquinina (1955), el desarrollo en este campo ha sido meteórico. El cultivo in vitro de define como "El cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, explante, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores" (Pierick, 1990).

En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la inducción de germinación en semillas, brotación en algunos tubérculos como la papa.

El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina. En 1939  Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.
Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la  selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales. La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la  producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril. 

II. DEFINICIÓN DE PROBLEMA

La presencia de microorganismos en el material utilizado para cultivo in vitro son el principal factor que pudiese contaminar el medio de cultivo y hacer radicalmente morir a los explantes sembrados.

III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

ü Manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo.

ü  La asimilación de habilidades en la siembra.


3.2 Objetivos específicos

ü  Manejar adecuadamente los explantes para su posterior siembra.

ü  Conocer las condiciones de asepsia para evitar la contaminación y propagación de microorganismos que reduzcan la probabilidad de que explantes tengan un crecimiento óptimo.


ü  Manejar adecuadamente el proceso de esterilización de materiales a utilizar para la siembra de explantes in vitro.

IV. JUSTIFICACIÓN

La presente práctica se llevó a cabo con la única finalidad de conocer la técnica de cultivo in vitro, así como los procedimientos para realizarla. Cabe mencionar que la técnica consiste en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Sin duda alguna el emplear esta técnica es muy importante pues tiene la ventaja de producir cantidades máximas de plantas e irlas multiplicando con solo extraer un nuevo explante. Es una manera optima de propagar grandes cantidades de plantas, tomando en cuenta las condiciones de asepsia para evitar que el cultivo in vitro pueda contaminarse por la presencia de microorganismos no deseados. La enseñanza y el conocimiento ya manejado son influyentes pues es de gran utilidad que el alumno conozca  la perfección cada uno de los procesos llevados a cabo en cuanto a la técnica de cultivo in vitro. Académicamente contribuye a que no solo estudiantes conozcan la importancia, ventajas y desventajas de la técnica de cultivo in vitro, sino para que este sea utilizado como tema central de la biotecnología para llevar a cabo proyectos, investigaciones que se realicen dentro del campo de estudio de biotecnología, podemos mencionar que es una técnica que no sólo el docente como biotecnologo debe conocer sino que toda la docencia que tiene a su cargo la carrera de biología debe conocer cuáles son las nuevas técnicas para propagar plantas para que tengan conocimiento extenso sobre la biotecnología.


V. FUNDAMENTO TEÓRICO

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.  El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la des diferenciación y luego la re diferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfo genética deseada es la composición del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micro propagación de una planta.

Para llevar adelante el cultivo in vitro, se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así que se desea trabajar. Además, se necesita un soporte para el explante, que puede ser sólido o líquido, y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explante elegido.

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.

Las nuevas tecnologías han aumentado los métodos a través de los cuales las plantas se pueden propagar de manera vegetativa. El cultivador debe decidir que método utilizar su elección dependerá de la velocidad con la que las nuevas plantas se precisen. Una de las alternativas es la utilización de las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales. El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una definición genérica que incluye el cultivo de protoplastos, de células, de tejidos, de órganos y de plantas. Estos diferentes tipos de cultivos tienen como factor común el crecimiento en condiciones estériles en un medio nutritivo, generalmente gelificado, y en condiciones ambientales controladas de (temperatura y luz), y por tanto óptimas.  La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

En la actualidad, una gran variedad de plantas se encuentran en peligro de extinción y para tratar de solucionar este problema se han establecido alternativas de conservación in situ con la declaración de parques nacionales, naturales, se reserva y bancos de germoplasma. Sin embargo, esta alternativa por sí misma resulta ineficiente para algunas especies con semillas recalcitrantes o estaría amenazada por desastres naturales, plagas y patógenos. Es por ello que el cultivo in vitro sirve de soporte para coadyuvar a tan ardua conservación con el resguardo de material clonal por largo tiempo y en un área relativamente pequeña.

Los tipos de colecciones in vitro son tres. Uno es el de crecimiento continuo de las colecciones bajo condiciones normales, por medio de una técnica de cultivo in vitro estándar. El segundo es un crecimiento lento (slow growth), a través de procedimientos de retardación. Esto último se puede lograr reduciendo la temperatura y/o la luz, induciendo estrés osmótico, la desecación, reduciendo los nutrimentos esenciales en el medio, o incorporando retardadores de crecimiento.
VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Material necesario para llevar a cabo el cultivo in vitro
Para realizar el cultivo in vitro se necesitaron pinzas, bisturíes, cajas de Petri, explantes que para este caso lo fue de la planta Manihot esculenta, campana de flujo, alcohol al 70 y 96 %, cloralex, agua estéril, frascos de vidrio con su previo medio de cultivo. Sin duda alguna los materiales otorgan ese punto esencial para llevar a cabo cada uno de los procedimientos necesarios para llevar a cabo el cultivo in vitro de plantas. Tomando en cuenta la asepsia y esterilización dentro del cultivo in vitro, pues siempre se debe de tomar en cuenta al máximo la esterilización de aquellos materiales como pinzas y bisturíes para poder lograr una higiene adecuada para realizar la siembra del explante en el medio de cultivo.

6.2 Procedimiento para realizar el cultivo in vitro de plantas
Lo primero que se realizo fue desinfectar los explantes con una mezcla de agua estéril y cloralex dejando pasar 5 minutos, una vez que pasaron los 5 minutos estos fueron lavados dos veces: el primer lavado se realizo por 1 minuto en agua estéril y el segundo lavado se realizo por 5 minutos de igual manera en agua estéril y una vez transcurrido el tiempo en cada uno de los lavados este era desechado, posteriormente se tomo con una pinza previamente esterilizada el explante y se colocó en caja de Petri para cortar aquellas partes que estaban quemadas por el cloralex y allí mismo con el bisturí esterilizado se cortaron las yemas axilares, es decir, los explantes que serían a sembradas en el medio de cultivo, seguidamente los explantes fueron sembrados con ayuda de una pinza la cual se  flameaba en cada momento que se realizaba la siembra con el fin de desinfectar y no inducir a que los medios de cultivo se contaminaran, finalmente los frascos fueron sellados con plástico en la parte de la tapadera con el fin de evitar contaminación.

VII. RESULTADOS

7.1 Cultivo de tejidos in vitro
Para llevar a cabo el cultivo de tejidos in vitro lo primero que se realizó fue esterilizar con alcohol al 70% la campana de flujo para eliminar los microorganismos que pudiesen estar presentes en esta. Posteriormente la persona que se dedicó al cultivo in vitro se mantuvo en condiciones óptimas de asepsia para no contaminar los medios de cultivo ni los explantes.  Seguidamente se realizaron los siguientes pasos:
ü  En un frasco con agua estéril y cloralex se agregaron los explantes por 5 minutos haciendo movimientos para desinfestarlos bien.
ü  Una vez pasados los 5 minutos se les retiro a los explantes la mezcla de agua estéril con cloralex
ü  Posteriormente se realizo el primer lavado de explantes con agua estéril por 1 minuto y seguidamente el segundo lavado por 5 minutos con el fin de retirar la mezcla de agua estéril y cloralex que pudiese haber quedado
ü  Una vez que estos fueron lavados se procedió a cortar aquellas partes que se quemaron con el cloralex, una vez retiradas las partes quemadas se corto con ayuda de un bisturí y con la pinza previamente esterilizados a flameo, cada una de las yemas axilares del explante
ü  Las yemas axilares obtenidas fueron sembradas al medio de cultivo con ayuda de pinza previamente esterilizada, siendo un total de 12 explantes sembrados
ü  Finalmente una vez que los explantes fueron fueron sembrados, se sello con plástico alrededor de la tapa del frasco con el fin de evitar la contaminación del medio de cultivo y por ende de los explantes.



 A                                                      B



 C                                                              D

E


Fig. 1- a) agregado de cloralex al agua estéril para desinfectar los explantes de Manihot esculenta, b) preparando los explante para realizar los dos lavados: uno por 1 minuto y el segundo por 5 minutos con el fin de retirar el exceso de cloralex, c) medio de cultivo con el respectivo explante contaminado por hongos, d) medio de cultivo con el respectivo explante contaminado por bacterias, e) medios de cultivo con sus respectivos explantes libres de hongos y bacterias.

7.2 Cultivos de tejidos in vitro excentos y no excentos de contaminación por microorganismos
La falta del lugar apropiado para llevar a cabo dicha práctica fue el principal factor por el que 8 de 12 medios de cultivo en los que se cultivo el tejido de Manihot esculenta se contaminaron, mostrando así una cantidad de 5 medios de cultivo contaminado por hongos y 3 medios de cultivo contaminados por bacterias. Cabe mencionar que no sólo influyo el hecho de que la campana de flujo estuviese en malas condiciones sino que en la observación macroscópica que se observo sobre aquellos medios de cultivo contaminados se pudo ver claramente que las bacterias que se encontraban justamente en lo que era el explante indicaba de alguna manera que el explante al ser cultivado ya se encontraba infestado por este tipo de microorganismo.
7.3 Calculo en porcentaje total de medios de cultivos contaminados por microorganismos
*      Porcentaje total de medios de cultivo contaminados por hongos

12 ---------- 100%
 5 ----------- x

         (5) (100)         500
   X=  ------------  =   ------ =  41.6%
               12              12




*      Porcentaje total de medios de cultivo contaminados por bacterias

12 ---------- 100%
 3 ----------- x

         (3) (100)         300
   X=  ------------  =   ------ =  25%
               12              12

*      Porcentaje total de medios de cultivo libres de hongos y bacterias

12 ---------- 100%
 4 ----------- x

         (4) (100)         400
   X=  ------------  =   ------ =  33.3%
               12              12

*      Representación grafica de resultados obtenidos
DATOS
Medios de cultivo
Porcentaje total
Contaminación por hongos
41.6 %
contaminación por bacterias
33.3 %
Libres de hongos y bacterias
25 %


VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

ü  El conocimiento y manejo adecuado de cada uno de los procedimientos para realizar el cultivo in vitro es de importancia para no tener errores en cuanto al manejo y siembra de explantes.

ü  El cultivo  de explantes vegetales es de gran importancia en cuanto a la biotecnología y la industria, pues por medio del cultivo in vitro se pueden obtener masivas propagaciones de plantas.


ü  Se debe de tomar en cuenta que si no se tienen los conocimientos previos y la eficacia de realizar la metodología adecuada para el cultivo in vitro, tomando en cuenta que la asepsia es indispensable para evitar contaminación, y si no hay buen manejo de asepsia esta se verá reflejada en aquellos cultivos in vitro que se encuentren contaminados.

ü  Se debe de tener buenas prácticas y conocimientos sobre cómo manejar los tejidos vegetales ya que estos están expuestos a contaminarse.


ü  El uso de buenos espacios para realizar el manejo y preparación de cultivo de tejidos in vitro, hacen de alguna manera la práctica más eficaz.

ü  El conocimiento adecuado sobre el manejo de las condiciones de asepsia y esterilización para la preparación de cultivo de tejidos in vitro contribuye a realizar una práctica más sencilla y sin errores.


IX. FUENTES CONSULTADAS
ü  Abdelnour Ana & Escalant Jean Vincent. 1994. Conceptos básicos del cultivo de tejidos vegetales.  Ventajas de los cultivos in vitro y factores que intervienen en el cultivo de tejido. Pág. 7-8

ü  Medina Ricardo, Faloci Mirta & colaboradores. Variabilidad Isoenzimática de plantas de arroz (Oryza sativa L.) regeneradas In viro a partir de callos. Argentina. http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/agrarias/a-001.pdf


ü  M. Roca William, Mroginski Luis A. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cultivo in vitro. Colombia. Pág. 20-25

Páginas web consultadas
ü   Consejo argentino para la información y el desarrollo de la biotecnología. 2007. http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=56

ü  Cultivo in vitro en especies del género Pinus. http://www.ilustrados.com/tema/395/Cultivo-vitro-especies-genero-Pinus.html


ü  Historia de cultivo de tejidos. 2007. http://natalymosquera.blogspot.mx/

ü  Segretin Maria Eugenia. Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de células vegetales). http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf