25/03/12
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
BIOTECNOLOGIA APLICADA EN LA BIOLOGÍA
SUBCULTIVO
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN-VITRO)
QUE PRESENTA:
ALFREDO ORTIZ MARTÍNEZ
YOLANDA E. MORENO HERNÁNDEZ
HELMER MARTÍNEZ CASARRUBIAS
MA. ALEYDA LÓPEZ HARRISON
ELIDENE PÉREZ QUINTANA
LAURA ORTEGA TORRES
LIC. BIOLOGÍA
CD. ALTAMIRANO, GUERRERO. MÉXICO. MARZO 23 DEL
2012
AGRADECIMIENTOS
A
dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de nuestros propósitos con
respecto a nuestra carrera, ya que en momentos difíciles siempre está para
apoyarnos cuando más lo necesitamos.
A nuestros
padres ya que sin su apoyo incondicional no estaríamos ahora estudiando una
licenciatura y la manera de animarnos a seguir estudiando para tener un futuro
mejor.
A
nuestros hermanos que, siempre están allí en las buenas y malas para ayudarnos
y darnos ánimos de seguir luchando y seguir adelante para cumplir con cada uno
de nuestros objetivos.
A
los que integran este equipo: Alfredo, Yolanda, Helmer, Ma. Aleyda y Elidene,
Laura ya que sin la unión y el trabajo en equipo de llevar a cabo esta práctica
seria más tedioso el realizar dicha práctica.
A nuestra escuela el IT de Cd Altamirano por
facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno de los procedimientos de
investigación y aprendizaje que se requieren en dicha asignatura, así como el
material y equipo de laboratorio que se utiliza en el transcurso de cada
práctica.
Al
M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro motor de aprendizaje ya que
sin su apoyo, la práctica sería muy difícil de llevarla a cabo.
RESUMEN
La
presente práctica tuvo como objetivos el manejo apropiado del material vegetal en
cámara de flujo y la asimilación de habilidades
en la siembra. Usualmente el cultivo
de tejidos in vitro consiste en aislar una porción de la planta (explante) y
proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas
para que las células expresen su potencial de regenerar una planta nueva.
Dentro de los puntos básicos importantes para llevar a cabo dicha práctica para
obtener resultados factibles fueron los siguientes: se lavaron los explantes
con agua estéril y cloralex para desinfestar y así obtener explantes limpios de
microorganismos que pudiesen contaminar el medio de cultivo así como el
explante, se esterilizó a flama los materiales a utilizar para el sembrado con
el fin de eliminar la presencia de microorganismos, cabe mencionar que la
esterilización formó parte central de la práctica pues se tuvo que tener las
condiciones de asepsia para evitar al máximo la propagación de microorganismos
no deseados.
ABSTRACT
This practice aimed to proper handling of plant material flow chamber and the assimilation of skills in planting. Usually the in vitro tissue culture is to isolate a portion of the plant (explant) and artificially provide physical and chemical
conditions appropriate for the cells to express their potential to regenerate a new plant. Among the important points to carry out this practice to obtain feasible results were as follows: the explants were washed with sterile water and Cloralex to disinfect and clean obtain explants of microorganisms that might contaminate the culture medium and the explant a flame sterilized materials to be used for seeding in order to eliminate the presence of microorganisms, it is noteworthy that the central sterilization formed practice because it had to be aseptic conditions in order to minimize the spread of microorganisms desired.
ÍNDICE
I.
Antecedentes…………………………………………………….. 5 - 6
II.
Definición del problema………………………………………….7
III.
Objetivos…………………………………………………………...8
3.1 General
3.2 Especifico
IV.
Justificación………………………………………………………..9
V.
Fundamento teórico………………………………………………10 -
12
VI.
Materiales y métodos……………………………………………..13
VII.
Resultados………………………………………………………....14 -
18
VIII.
Conclusiones y recomendaciones……………………………....19
IX.
Fuentes consultadas……………………………………………...20
I. ANTECEDENTES
La historia
del cultivo in vitro de tejidos vegetales se remonta a unos 200 años, con la
"Teoría de la Totipotencia" formulada por Schwann y Schleiden (1838).
A partir de esta teoría nació el cultivo de tejidos y células vegetales. Un
siglo después, Nobécourt, Gautheret y White (1939) consiguieron el primer
cultivo de tejidos vegetales auténtico in vitro. A partir de ése entonces y con
los descubrimientos de las fitohormonas auxina y citoquinina (1955), el
desarrollo en este campo ha sido meteórico. El cultivo in vitro de define como
"El cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de
plantas, semillas, embriones, órganos, explante, tejidos, células y
protoplastos de plantas superiores" (Pierick, 1990).
En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal,
actualmente de uso ordinario en el cultivo in
vitro de tejidos vegetales
denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este
compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en
plántulas de arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento
excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se
le atribuyen otros efectos como la inducción de germinación en semillas,
brotación en algunos tubérculos como la papa.
El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934,
quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con
sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por
tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina. En
1939 Gautheret, Nobecourt (en tejidos de
zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la
formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los
explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo
constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.
Un
factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos
vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek
(1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que
estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se
combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria
y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).
Actualmente se ha convertido en una
herramienta internacional importante en la
selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de
cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura,
horticultura, forestales y frutales. La ciencia del cultivo de tejidos
vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el
crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas
básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en
medios estériles para la producción de
microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología
por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número,
o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de
tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente
estéril.
II. DEFINICIÓN DE PROBLEMA
La
presencia de microorganismos en el material utilizado para cultivo in vitro son el principal factor que
pudiese contaminar el medio de cultivo y hacer radicalmente morir a los
explantes sembrados.
III. OBJETIVOS
3.1
Objetivo general
ü Manejo apropiado del
material vegetal en cámara de flujo.
ü La asimilación de habilidades
en la siembra.
3.2
Objetivos específicos
ü Manejar
adecuadamente los explantes para su posterior siembra.
ü Conocer
las condiciones de asepsia para evitar la contaminación y propagación de
microorganismos que reduzcan la probabilidad de que explantes tengan un
crecimiento óptimo.
ü Manejar
adecuadamente el proceso de esterilización de materiales a utilizar para la
siembra de explantes in vitro.
IV. JUSTIFICACIÓN
La
presente práctica se llevó a cabo con la única finalidad de conocer la técnica
de cultivo in vitro, así como los procedimientos para realizarla. Cabe
mencionar que la técnica consiste en
aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las
condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su
potencial intrínseco o inducido. Sin duda alguna el emplear esta técnica es muy
importante pues tiene la ventaja de producir cantidades máximas de plantas e
irlas multiplicando con solo extraer un nuevo explante. Es una manera optima de
propagar grandes cantidades de plantas, tomando en cuenta las condiciones de
asepsia para evitar que el cultivo in vitro pueda contaminarse por la presencia
de microorganismos no deseados. La enseñanza y el conocimiento ya
manejado son influyentes pues es de gran utilidad que el alumno conozca la perfección cada uno de los procesos
llevados a cabo en cuanto a la técnica de cultivo in vitro. Académicamente
contribuye a que no solo estudiantes conozcan la importancia, ventajas y
desventajas de la técnica de cultivo in vitro, sino para que este sea utilizado
como tema central de la biotecnología para llevar a cabo proyectos,
investigaciones que se realicen dentro del campo de estudio de biotecnología,
podemos mencionar que es una técnica que no sólo el docente como biotecnologo
debe conocer sino que toda la docencia que tiene a su cargo la carrera de
biología debe conocer cuáles son las nuevas técnicas para propagar plantas para
que tengan conocimiento extenso sobre la biotecnología.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo in vitro consiste
en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por
ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo,
embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril
(usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. El
cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es
una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a
partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco
tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre,
cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas
y químicas controladas en un medio de cultivo.
La formulación del medio
cambia según se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas
y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales. El éxito en la propagación de una planta
dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es
decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin,
debe inducirse primero la des diferenciación y luego la re diferenciación
celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces
adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias.
Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta
morfo genética deseada es la composición del medio de cultivo.
No existen dudas que en
todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo,
el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y
que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico
del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que
ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la
acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se
emplean en los medios de cultivo para conseguir la micro propagación de una
planta.
Para llevar adelante el
cultivo in vitro, se necesitan equipamientos que generen las condiciones
necesarias de esterilidad, como los flujos
laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire
filtrado y estéril, protegiendo así que se desea trabajar. Además, se necesita
un soporte para el explante, que puede ser sólido o líquido, y que está
conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.),
macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta,
nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del
crecimiento y hormonas vegetales que ayudarán a obtener una planta o un órgano
en particular, a partir del explante elegido.
A diferencia de
las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la
propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo
de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran
utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas,
en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería
genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que
en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de
cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas
ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la
estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.
Las nuevas tecnologías han aumentado los métodos a través
de los cuales las plantas se pueden propagar de manera vegetativa. El
cultivador debe decidir que método utilizar su elección dependerá de la
velocidad con la que las nuevas plantas se precisen. Una de las alternativas es
la utilización de las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales. El
cultivo in vitro de tejidos vegetales
es una definición genérica que incluye el cultivo de protoplastos, de células,
de tejidos, de órganos y de plantas. Estos diferentes tipos de cultivos tienen
como factor común el crecimiento en condiciones estériles en un medio
nutritivo, generalmente gelificado, y en condiciones ambientales controladas de
(temperatura y luz), y por tanto óptimas.
La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro)
constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al
desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de
especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y
forestales.
En la actualidad, una gran
variedad de plantas se encuentran en peligro de extinción y para tratar de
solucionar este problema se han establecido alternativas de conservación in
situ con la declaración de parques nacionales, naturales, se reserva y
bancos de germoplasma. Sin embargo, esta alternativa por sí misma resulta
ineficiente para algunas especies con semillas recalcitrantes o estaría
amenazada por desastres naturales, plagas y patógenos. Es por ello que el
cultivo in vitro sirve de soporte para coadyuvar a tan ardua
conservación con el resguardo de material clonal por largo tiempo y en un área
relativamente pequeña.
Los tipos de colecciones in
vitro son tres. Uno es el de crecimiento continuo de las colecciones
bajo condiciones normales, por medio de una técnica de cultivo in vitro estándar.
El segundo es un crecimiento lento (slow growth), a través de
procedimientos de retardación. Esto último se puede lograr reduciendo la
temperatura y/o la luz, induciendo estrés osmótico, la desecación,
reduciendo los nutrimentos esenciales en el medio, o incorporando
retardadores de crecimiento.
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Material necesario para llevar a cabo el cultivo in vitro
Para realizar el cultivo in vitro se necesitaron pinzas, bisturíes, cajas de Petri, explantes
que para este caso lo fue de la planta Manihot esculenta,
campana de flujo, alcohol al 70 y 96 %, cloralex, agua estéril, frascos de
vidrio con su previo medio de cultivo. Sin duda alguna los materiales otorgan
ese punto esencial para llevar a cabo cada uno de los procedimientos necesarios
para llevar a cabo el cultivo in vitro de plantas. Tomando en cuenta la
asepsia y esterilización dentro del cultivo in vitro, pues siempre se
debe de tomar en cuenta al máximo la esterilización de aquellos materiales como
pinzas y bisturíes para poder lograr una higiene adecuada para realizar la
siembra del explante en el medio de cultivo.
6.2
Procedimiento para realizar el cultivo in vitro de plantas
Lo
primero que se realizo fue desinfectar los explantes con una mezcla de agua estéril
y cloralex dejando pasar 5 minutos, una vez que pasaron los 5 minutos estos
fueron lavados dos veces: el primer lavado se realizo por 1 minuto en agua estéril
y el segundo lavado se realizo por 5 minutos de igual manera en agua estéril y
una vez transcurrido el tiempo en cada uno de los lavados este era desechado, posteriormente
se tomo con una pinza previamente esterilizada el explante y se colocó en caja
de Petri para cortar aquellas partes que estaban quemadas por el cloralex y
allí mismo con el bisturí esterilizado se cortaron las yemas axilares, es
decir, los explantes que serían a sembradas en el medio de cultivo,
seguidamente los explantes fueron sembrados con ayuda de una pinza la cual
se flameaba en cada momento que se realizaba
la siembra con el fin de desinfectar y no inducir a que los medios de cultivo
se contaminaran, finalmente los frascos fueron sellados con plástico en la
parte de la tapadera con el fin de evitar contaminación.
VII. RESULTADOS
7.1 Cultivo de tejidos in
vitro
Para llevar a cabo el cultivo de tejidos in
vitro lo primero que se realizó fue esterilizar con alcohol al 70% la campana
de flujo para eliminar los microorganismos que pudiesen estar presentes en
esta. Posteriormente la persona que se dedicó al cultivo in vitro se mantuvo en
condiciones óptimas de asepsia para no contaminar los medios de cultivo ni los
explantes. Seguidamente se realizaron
los siguientes pasos:
ü En un frasco con agua estéril y cloralex se
agregaron los explantes por 5 minutos haciendo movimientos para desinfestarlos
bien.
ü Una vez pasados los 5 minutos se les retiro a
los explantes la mezcla de agua estéril con cloralex
ü Posteriormente se realizo el primer lavado de
explantes con agua estéril por 1 minuto y seguidamente el segundo lavado por 5
minutos con el fin de retirar la mezcla de agua estéril y cloralex que pudiese
haber quedado
ü Una vez que estos fueron lavados se procedió a
cortar aquellas partes que se quemaron con el cloralex, una vez retiradas las
partes quemadas se corto con ayuda de un bisturí y con la pinza previamente
esterilizados a flameo, cada una de las yemas axilares del explante
ü Las yemas axilares obtenidas fueron sembradas
al medio de cultivo con ayuda de pinza previamente esterilizada, siendo un
total de 12 explantes sembrados
ü Finalmente una vez que los explantes fueron
fueron sembrados, se sello con plástico alrededor de la tapa del frasco con el
fin de evitar la contaminación del medio de cultivo y por ende de los
explantes.
A B
C D
E
Fig. 1- a) agregado de cloralex al agua estéril para
desinfectar los explantes de Manihot esculenta,
b) preparando los explante para realizar los dos lavados: uno por 1 minuto y el
segundo por 5 minutos con el fin de retirar el exceso de cloralex, c) medio de
cultivo con el respectivo explante contaminado por hongos, d) medio de cultivo
con el respectivo explante contaminado por bacterias, e) medios de cultivo con
sus respectivos explantes libres de hongos y bacterias.
7.2 Cultivos de tejidos in
vitro excentos y no excentos de contaminación por microorganismos
La falta del lugar apropiado para llevar a cabo
dicha práctica fue el principal factor por el que 8 de 12 medios de cultivo en
los que se cultivo el tejido de Manihot esculenta se contaminaron, mostrando así una cantidad de 5
medios de cultivo contaminado por hongos y 3 medios de cultivo contaminados por
bacterias. Cabe mencionar que no sólo influyo el hecho de que la campana de
flujo estuviese en malas condiciones sino que en la observación macroscópica que
se observo sobre aquellos medios de cultivo contaminados se pudo ver claramente
que las bacterias que se encontraban justamente en lo que era el explante
indicaba de alguna manera que el explante al ser cultivado ya se encontraba
infestado por este tipo de microorganismo.
7.3 Calculo en porcentaje total de medios de
cultivos contaminados por microorganismos
Porcentaje total de medios de
cultivo contaminados por hongos
12 ---------- 100%
5
----------- x
(5) (100) 500
X= ------------ =
------ = 41.6%
12 12
|
Porcentaje total de medios de
cultivo contaminados por bacterias
12 ---------- 100%
3
----------- x
(3) (100) 300
X= ------------ =
------ = 25%
12 12
|
Porcentaje total de medios de
cultivo libres de hongos y bacterias
12 ---------- 100%
4
----------- x
(4) (100) 400
X= ------------ =
------ = 33.3%
12 12
|
Representación grafica de
resultados obtenidos
DATOS
Medios de cultivo
|
Porcentaje total
|
Contaminación por hongos
|
41.6 %
|
contaminación por bacterias
|
33.3 %
|
Libres de hongos y bacterias
|
25 %
|
VIII.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
ü El
conocimiento y manejo adecuado de cada uno de los procedimientos para realizar
el cultivo in vitro es de importancia para no tener errores en cuanto al manejo
y siembra de explantes.
ü El
cultivo de explantes vegetales es de
gran importancia en cuanto a la biotecnología y la industria, pues por medio
del cultivo in vitro se pueden
obtener masivas propagaciones de plantas.
ü Se
debe de tomar en cuenta que si no se tienen los conocimientos previos y la
eficacia de realizar la metodología adecuada para el cultivo in vitro, tomando en cuenta que la
asepsia es indispensable para evitar contaminación, y si no hay buen manejo de
asepsia esta se verá reflejada en aquellos cultivos in vitro que se encuentren contaminados.
ü Se
debe de tener buenas prácticas y conocimientos sobre cómo manejar los tejidos
vegetales ya que estos están expuestos a contaminarse.
ü El
uso de buenos espacios para realizar el manejo y preparación de cultivo de
tejidos in vitro, hacen de alguna
manera la práctica más eficaz.
ü El
conocimiento adecuado sobre el manejo de las condiciones de asepsia y
esterilización para la preparación de cultivo de tejidos in vitro contribuye a realizar una práctica más sencilla y sin
errores.
IX.
FUENTES CONSULTADAS
ü Abdelnour
Ana & Escalant Jean Vincent. 1994. Conceptos básicos del cultivo de tejidos
vegetales. Ventajas de los cultivos in
vitro y factores que intervienen en el cultivo de tejido. Pág. 7-8
ü Medina
Ricardo, Faloci Mirta & colaboradores. Variabilidad Isoenzimática de
plantas de arroz (Oryza sativa L.) regeneradas In viro a partir de callos.
Argentina. http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/agrarias/a-001.pdf
ü M. Roca William, Mroginski Luis A. 1993. Cultivo
de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cultivo in vitro.
Colombia. Pág. 20-25
Páginas web consultadas
ü Consejo argentino para la información y el
desarrollo de la biotecnología. 2007. http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1¬e=56
ü Cultivo in vitro en
especies del género Pinus. http://www.ilustrados.com/tema/395/Cultivo-vitro-especies-genero-Pinus.html
ü Historia
de cultivo de tejidos. 2007. http://natalymosquera.blogspot.mx/
ü Segretin
Maria Eugenia. Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de células
vegetales). http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf