domingo, 11 de marzo de 2012

practica 3 preparacion de medios para el cultivo de tejidos vegetales

07/03/12
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA BIOLOGÍA

PRACTICA 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL  CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 



QUE PRESENTA:

ALFREDO ORTIZ MARTÍNEZ

YOLANDA E. MORENO HERNÁNDEZ

HELMER MARTÍNEZ CASARRUBIAS

MA. ALEYDA LÓPEZ HARRISON

ELIDENE PÉREZ QUINTANA




AGRADECIMIENTOS

A dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de nuestros propósitos con respecto a nuestra carrera, ya que en momentos difíciles siempre está para apoyarnos cuando más lo necesitamos.

A nuestros padres ya que sin su apoyo incondicional no estaríamos ahora estudiando una licenciatura y la manera de animarnos a seguir estudiando para tener un futuro mejor.

A nuestros hermanos que, siempre están allí en las buenas y malas para ayudarnos y darnos ánimos de seguir luchando y seguir adelante para cumplir con cada uno de nuestros objetivos.
A los que integran este equipo: Alfredo, Yolanda, Helmer, Ma. Aleyda y Elidene ya que sin la unión y el trabajo en equipo de llevar a cabo esta práctica seria más tedioso el realizar dicha práctica

A  nuestra escuela el IT de cd Altamirano por facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno de los procedimientos de investigación y aprendizaje que se requieren en dicha asignatura, así como el material y equipo de laboratorio que se utiliza en el transcurso de cada práctica.

Al M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro motor de aprendizaje ya que sin su apoyo, la práctica sería muy difícil de llevarla a cabo.

RESUMEN

La presente práctica tuvo como objetivo Conocer la forma de preparación de los medios de Murashigue y Skoog y B5 ( o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales. A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre de patógenos. Se pesó adecuadamente los ingredientes que forman parte del medio de cultivo, la sacarosa y phytagel, así mismo se siguieron ciertos pasos para poder conocer como se realiza un medio de cultivo de este tipo, donde se empezó por mezclar las soluciones stock, agregar sacarosa, aforar a 350 ml, medir el pH de la solución, seguidamente  se cocino el medio para posteriormente agregar el phytagel y se dejo enfriar para que este fuese vaciado a frascos en una cantidad de 25 ml y finalmente refrigerarlo.


ABSTRACT

This practice aimed to know the way of preparing and Skoog media Murashigue B5 (Gambord or) form plant tissue culture. In larger scale, as in the industry micropropagation, tissue culture has become a manufacturing process that can produce pathogen free plant material. Appropriately weighed ingredients forming part of the culture medium, sucrose and phytagel, likewise certain steps were followed in order to know how to perform a culture medium of this type, where it began by mixing stock solutions, adding sucrose dilute to 350 ml, measuring the pH of the solution is then  solution is then cook the means for adding the phytagel and subsequently allowed to cool to this were emptied into vials in an amount of 25 ml and finally cooling.



ÍNDICE

                                                                                              

1.            Antecedentes…………………………………………………….. 5 - 7

2.            Definición del problema………………………………………….8


3.            Objetivos…………………………………………………………...9
1.            General
2.            Especifico

4.            Justificación………………………………………………………..10

5.            Fundamento teórico………………………………………………11 - 13


6.            Materiales y métodos……………………………………………..14 - 16

7.            Resultados………………………………………………………....17 - 20


8.            Conclusiones y recomendaciones……………………………....21 - 22

9.            Fuentes consultadas……………………………………………...23




I. ANTECEDENTES

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales  desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la  selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la  producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril. 

A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre o saneado de patógenos, de alta calidad, que puede atravesar fronteras internacionales.

Después de Haberlandt, no fue sino hasta los años 30's que White en Estados Unidos y Gautheret en Francia, demostraron de forma definitiva la posibilidad de cultivar células vegetales in vitro. En ese tiempo hubo dos grandes descubrimientos que repercutieron de manera fundamental sobre el desarrollo de la técnica de cultivo de células y tejidos vegetales: primero, la identificación de las auxinas como reguladoras naturales del crecimiento vegetal, y segundo, el reconocimiento de la importancia de las vitaminas del complejo B en el crecimiento de las plantas.

En 1934, Gautheret cultivó células de cambium de algunas especies en una solución mineral con glucosa y cloruro de cisteína. Encontró que dichas células proliferaban por algunos meses y que adicionando vitaminas y ácido indolacético (AIA) se estimulaba considerablemente su crecimiento. Estos investigadores junto con Nobecourt, quien reportó en ese mismo año el establecimiento de un cultivo similar a partir de zanahoria, son los tres investigadores considerados los pioneros de la técnica del cultivo de células y tejidos vegetales (Bhojwani y Razdan 1983, Street 1977).

El medio de Nitsch (1951) es esencialmente una modificación de la solución Knop, una de las primeras soluciones en el cultivo hidropónico (cerca de 1865). Este  medio fue útil en el cultivo de partes de flores de tomate; la concentración de sacarosa utilizada era de 5% en lugar de 2% ó 3% utilizado en muchos otros medios.

El medio de Brauen et al. (1962) es un medio de White modificado, ya que contiene 845 mg/litro de KCI, 1800 mg/ litro de NaNO3, 300 mg/litro de NaH2PO4.H2O y 790 mg/ litro de (NH4)2SO4, además de los que se encuentra en un medio (mineral) basal de White. También se añaden algunos suplementos orgánicos, por ejemplo la glutamina y la asparagina, y los dos nucleótidos ácido cítidílico y ácido guanílico; el inostol también está presente (100 mg/litro).
El medio revisado que propusieron Murashigue y Skoog es esencialmente una modificación de la fórmula basal original de White, a la que se añadieron 1650 mg/litro de NH4NO3 al igual que 170 mg/litro de KH2PO4. El CaCl2 remplazó al Ca (NO3)2; por consiguiente, este medio es de alta salinidad y puede esperarse que sustente el crecimiento de ciertos cultivos que requieren concentraciones más altas de iones. 

II. DEFINICIÓN DE PROBLEMA
  Los medios de cultivo son severamente sensibles a contaminarse si no se tiene cuidado
y manejo adecuado de estos.

III. OBJETIVOS



3.1 Objetivo general

1.       Conocer la forma de preparación de los medios de Murashigue y Skoog y B5 ( o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales.


3.2 Objetivos específicos

2.       Conocer y mantener adecuadamente el pH optimo para el medio de cultivo que será destinado para cultivo de vegetales

3.         Conocer cada uno de los procedimientos necesarios para llevar a cabo la preparación de medios de cultivo

4.            Identificar cada uno de los nutrientes necesarios para el medio de cultivo


IV. JUSTIFICACIÓN

La presente práctica se realizó con la finalidad de realizar medios de cultivo para tejidos vegetales pues el hecho de conocer el método adecuado y eficaz para llevar a cabo la técnica es de gran importancia. Cabe mencionar que además la importancia del medio de cultivo consiste en reconocer e identificar claramente aquellas prácticas y procedimientos que son llevados a cabo con gran cuidado y manejo higiénico pues este medio de cultivo es bastante propenso a contaminarse lo cual sería un desastre en cuanto al medio de cultivo y por ende no podría ser utilizado para el cultivo de plantas. Sin duda alguna la enseñanza y el conocimiento ya manejado son influyentes pues es de gran utilidad que el alumno conozca  la perfección cada uno de los procesos llevados a cabo en cuanto a la preparación de medios de cultivo.
  
V. FUNDAMENTO TEÓRICO

El cultivo de tejidos vegetales es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas.

Casi cualquiera de las fórmulas salinas basales de las soluciones de cultivo que se tienen actualmente como estándar debería ser más que suficiente para suministrar un mínimo esencial de los elementos requeridos. Sin embargo, sería útil ensayar estas soluciones a diferentes concentraciones totales; por ejemplo, el de Murashige es un medio relativamente “alto contenido de sal”, mientras el medio de White generalmente se considera como de “bajo contenido de sal”. Muchos explantes crecen mejor se  les suministra nitrógeno reducido, lo que se puede hacer agregando sales de NH4+ o suplementando con urea. El valor medio de MS se atribuye en parte de a sus altos niveles de NH4+ (y de K).

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles).
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).

El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es necesario además adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana (Roca & Mroginski).




A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. (Aceves & Hernández).  Las ventajas que otorga el cultivo de tejidos son: uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para erradicar patógenos. Propagación clonal masiva de plantas libres de enfermedades en corto tiempo. Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento de germoplasma en campo. Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del año. Facilita el intercambio de material genético. Reduce el riesgo de pérdidas genéticas al evitar la mezcla del material por cruzamiento.

Todos los medios parecen beneficiarse en cierto grado con los suplementos vitamínicos, a menos que las células se vuelvan verdes o hasta que ello ocurra; los aditivos mínimos usuales son la tiamina, el ácido nicotínico y la piridoxina. Por consiguiente, los suplementos vitamínicos son más o menos estándar; en realidad, la tiamina-HCl, como única vitamina añadida, puede ser suficiente en muchos casos (Linsmaier et al., 1965).

Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o manipuladas genéticamente, han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación vegetativa para erradicar infecciones por virus y para introducir variaciones genotípicas que aumenten la calidad de los productos. Estas técnicas se conocen genéricamente como cultivo in vitro.

Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.

El medio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células.

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Componentes necesarios para preparar medio de cultivo
Componente
Cantidad necesaria para agregar
Nitratos
3.5 ml
Sulfatos
3.5 ml
Quelatos
3.5 ml
PoMoBo
3.5 ml
Halógenos
3.5 ml
Orgánicos
3.5 ml
Carbohidratos (sacarosa)
10.5 g
Phytagel
1.05 g

6.2 Material y soluciones necesarias para preparar medios de cultivo
Para llevar a cabo dicha práctica se utilizaron los materiales y soluciones siguientes: balanza analítica, vaso de precipitado, pipeta, plancha, frascos, probeta, potenciómetro, soluciones stock

a)                                                             b)
 c)                                                          d)
 e)                                                            f)
g)



Fig. 1- a) Balanza analítica, b) Vasos de precipitado y pipeta, c) plancha, d) frascos, e) probeta graduada, f) potenciómetro, g) solución stock

6.3 Procedimiento para preparar medio de cultivo
Se pesó en una balanza analítica 10.5 g de sacarosa y de phytagel 1.05, seguidamente en un vaso de precipitado se agregó cada uno de los componentes (soluciones stock la cantidad de 3.5 ml igualitariamente), posteriormente se agregó la sacarosa y por consiguiente se aforo a 350 ml, seguidamente se vació a un vaso de precipitado para medir el pH de la solución, penúltimamente se cocino el medio de cultivo calentando a 50°-70°C y se agregó el phytagel y por último se dejo enfriar un poco el medio de cultivo y se vació a frascos una cantidad de 25ml

 a)                                                           b)
c)                                                            d)
 
e)                                                            f)
 
g)                                                           h)
 
i)                                                            j)
 
k)                                                   l)
 
m)                                                             n)

Fig. 2- a) se tomo 3.5 ml de nitratos, b) se tomo 3.5 ml de sulfatos, c) se tomo 3.5 ml de quelatos, d) se tomo 3.5 de PoMoBo, e) se tomo 3.5 ml de halógenos, f) se tomo 3.5 ml de orgánicos, g) se agregó la sacarosa, h) se disolvió la sacarosa, i) se aforo a 350 ml, j)-k) se agrego a vaso de precipitado para medir el pH, l) se calentó en plancha el medio de cultivo, m) se agregó el phytagel a la solución, n) se agregó 25 ml a cada uno de los frascos

VII. RESULTADOS
Los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios pues se logro realizar los medios de cultivo con las cantidades exactas de las soluciones stock para agregar y mezclar, aunque antes de todo lo primero que se realizo fue llevar a cabo cada una de los cálculos para poder conocer la cantidad exacta de soluciones stock, sacarosa y phytagel que se debía pesar y diluir.

7.1 Calculo se soluciones Stock para medio de cultivo
1.    Preparar 350 ml de solución stock para medio de cultivo a una concentración de 100x

CALCULOS A REALIZAR
Para componentes de medios de cultivo (soluciones stock)
V1C1= V2C2
                   V2=  V1C1  =  350 ml . 1x    =  350 ml   3.5 ml
                              C2            100 x               100 x

Componente
Calculo realizado
Nitratos
3.5 ml
Sulfatos
3.5 ml
Quelatos
3.5 ml
PoMoBo
3.5 ml
Halógenos
3.5 ml
Orgánicos
3.5 ml

    

  Para sacarosa

CALCULOS A REALIZAR

 30 g ---------------- 1 L = 1000 ml
     x? -------------------  350 ml

30 g (350 ml)              10, 500 g/ml
-------------------     =     ---------------  =   10.5 g                        
     1000 ml                   1000 ml


Para  phytagel

CALCULOS A REALIZAR

 2.7 g ---------------- 1 L = 1000 ml
     x? -------------------  350 ml

2.7 g (350 ml)              1050 g/ml
-------------------     =     ---------------  =   10.5 g                        
     1000 ml                   1000 ml



7.2 Procedimiento realizado para preparar medio de cultivo (M & S)
 Lo primero que se realizó fue pesar con ayuda de una balanza analítica la sacarosa (10.5 g) y phytagel (1.05 g), posteriormente con ayuda de una pipeta se tomó 3.5 ml de cada una de las soluciones stock para agregarlas en un vaso de precipitado, una vez que se termino de mezclar las soluciones se agregó la sacarosa, una vez que esta fue completamente diluida se aforo a 350 ml en una probeta graduada, seguidamente fue vertido a un vaso de precipitado para medir el pH en el que si la solución marcaba un rango menor a 5.7 se agregó un ácido y si el rango era superior a 6.0 se agregaba una base, para este caso el pH marcado era ácido por lo que se opto por agregar una base para mantenerlo a un pH igual a 5.7 o mayor y menor de 6.0, una vez que el pH fue medio de cocino el medio a una temperatura de 50°-70°C y se agregó seguidamente el phytagel poco a poco con el fin de que se formase bolas de phytagel, una vez agregado todo el phytagel se dejo hervir durante 1-2 minutos y se dejo enfriar para finalmente agregar 25 ml del medio de cultivo a los 14 frascos.

 a)                                                          b)
 c)                                                           d)
 e)                                                             f)
 g)                                                         h)
 i)                                                          j)
 k)                                                        k)
 l)                                                          m)
 n)                                                             o)
p)

Fig 3. –a) se tomó 3.5 ml de nitratos, b) se tomó 3.5 ml de sulfatos, c) se tomó 3.5 ml de quelatos, d) se tomó 3.5 ml de PoMoBo, e) se tomó 3.5 ml de halógenos, f) se tomó 3.5 ml de orgánicos, g) se agregó la sacarosa, h) se disolvió la sacarosa, i) se aforó a 350 ml, j) los 350 ml de solución fue vaciado a vaso de precipitado, k) se medio el pH el cual al principio fue de 3.98 lo cual indicaba una solución ácida, l) nuevamente se midió el pH pero agregando la base para mantener el rango optimo que en este caso lo fue de 5.72, m) se cocinó el medio de cultivo, n) se agregó el phytagel, ñ) al agregar el phytagel poco a poco se disolvió bien, o) se dejo enfriar muy poco, p) se vació a frascos la cantidad de 25 ml



VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

*      El medio de cultivo es un conjunto de ingredientes que otorgan los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de plantas cultivadas in vitro.

*      El conocimiento y manejo adecuado de cada uno de los procedimientos para realizar un medio de cultivo es de importancia para no obtener errores en cuanto a los requerimientos de las plantas.


*      El conocer y saber realizar cálculos correctos para conocer la cantidad exacta de constituyentes para cierto volumen de medio de cultivo es importante para no tener errores en cuanto a cantidades.

*      El medio de cultivo y por ende el cultivo  de explantes vegetales es de gran importancia en cuanto a la biotecnología y la industria, pues por medio del cultivo in vitro se pueden obtener masivas propagaciones de plantas.


*      El medio de cultivo más utilizado y eficaz para la mayoría de las plantas fue el que dio a conocer Murashigue & Skoog.

*      Se debe de tomar en cuenta que si no se tienen los conocimientos previos y la eficacia de realizar cálculos para obtener cantidades exactas es un problema pues la deficiencia de alguno de los ingredientes que conformen el medio de cultivo se verá reflejado en el explante de planta que se pretenda cultivar.


*      Se debe de tener buenas prácticas y conocimientos sobre cómo manejar los medios de cultivo ya que estos están expuestos a contaminarse.

*      El uso de buenos espacios para realizar el manejo y preparación de medios de cultivo, hacen de alguna manera la práctica más eficaz.


*      El conocimiento adecuado sobre el manejo de ciertos equipos de laboratorio utilizados para la preparación de medios de cultivo contribuye a realizar una práctica más rápida,  sencilla y sin errores


IX. FUENTES CONSULTADAS

*      A.D. Krikorian. Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Componentes del medio de cultivo. E. U.

*      Graciano Calva Calva &  Josefina Pérez Varga. 2005. Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el futuro. http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/nov_art104a.pdf

*      L. A. Mroginski & W. M. Roca. Medios de cultivos de tejidos vegetales in vitro. Medios de cultivo: componentes

*      W.M. Morgan. Cultivo de tejido vegetal. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

















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