07/03/12
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA BIOLOGÍA
PRACTICA 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
QUE PRESENTA:
ALFREDO ORTIZ MARTÍNEZ
YOLANDA E. MORENO HERNÁNDEZ
HELMER MARTÍNEZ
CASARRUBIAS
MA. ALEYDA LÓPEZ
HARRISON
ELIDENE PÉREZ QUINTANA
AGRADECIMIENTOS
A dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de
nuestros propósitos con respecto a nuestra carrera, ya que en momentos
difíciles siempre está para apoyarnos cuando más lo necesitamos.
A nuestros padres ya que sin su apoyo incondicional no
estaríamos ahora estudiando una licenciatura y la manera de animarnos a seguir
estudiando para tener un futuro mejor.
A nuestros hermanos que, siempre están allí en las buenas
y malas para ayudarnos y darnos ánimos de seguir luchando y seguir adelante
para cumplir con cada uno de nuestros objetivos.
A los que integran este equipo: Alfredo, Yolanda, Helmer,
Ma. Aleyda y Elidene ya que sin la unión y el trabajo en equipo de llevar a
cabo esta práctica seria más tedioso el realizar dicha práctica
A nuestra escuela
el IT de cd Altamirano por facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno
de los procedimientos de investigación y aprendizaje que se requieren en dicha
asignatura, así como el material y equipo de laboratorio que se utiliza en el
transcurso de cada práctica.
Al M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro
motor de aprendizaje ya que sin su apoyo, la práctica sería muy difícil de
llevarla a cabo.
RESUMEN
La presente práctica tuvo como objetivo
Conocer la forma de preparación de los medios de Murashigue y Skoog y B5 ( o de
Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales. A su escala mayor, como ocurre
en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido
en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre de
patógenos. Se pesó adecuadamente los ingredientes que forman parte del medio de
cultivo, la sacarosa y phytagel, así mismo se siguieron ciertos pasos para
poder conocer como se realiza un medio de cultivo de este tipo, donde se empezó
por mezclar las soluciones stock, agregar sacarosa, aforar a 350 ml, medir el
pH de la solución, seguidamente se
cocino el medio para posteriormente agregar el phytagel y se dejo enfriar para
que este fuese vaciado a frascos en una cantidad de 25 ml y finalmente
refrigerarlo.
ABSTRACT
This
practice aimed to know the way of preparing and Skoog media Murashigue B5
(Gambord or) form plant tissue culture. In larger scale, as in the industry
micropropagation, tissue culture has become a manufacturing process that can
produce pathogen free plant material. Appropriately weighed ingredients forming
part of the culture medium, sucrose and phytagel, likewise certain steps were
followed in order to know how to perform a culture medium of this type, where
it began by mixing stock solutions, adding sucrose dilute to 350 ml, measuring
the pH of the solution is then solution
is then cook the means for adding the phytagel and subsequently allowed to cool
to this were emptied into vials in an amount of 25 ml and finally cooling.
ÍNDICE
1.
Antecedentes…………………………………………………….. 5 - 7
2.
Definición del problema………………………………………….8
3.
Objetivos…………………………………………………………...9
1.
General
2.
Especifico
4.
Justificación………………………………………………………..10
5.
Fundamento teórico………………………………………………11 - 13
6.
Materiales y métodos……………………………………………..14 -
16
7.
Resultados………………………………………………………....17 - 20
8.
Conclusiones y recomendaciones……………………………....21
- 22
9.
Fuentes consultadas……………………………………………...23
I.
ANTECEDENTES
El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de
la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en
una herramienta internacional importante en la
selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de
cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura,
horticultura, forestales y frutales.
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen
a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo
vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología
por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e
identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las
plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su
crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido
vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.
A su escala mayor, como ocurre en la industria de la
micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de
manufactura que puede producir material vegetal libre o saneado de patógenos,
de alta calidad, que puede atravesar fronteras internacionales.
Después de Haberlandt, no fue sino hasta los años 30's
que White en Estados Unidos y Gautheret en Francia, demostraron de forma
definitiva la posibilidad de cultivar células vegetales in vitro. En ese tiempo
hubo dos grandes descubrimientos que repercutieron de manera fundamental sobre
el desarrollo de la técnica de cultivo de células y tejidos vegetales: primero,
la identificación de las auxinas como reguladoras naturales del crecimiento
vegetal, y segundo, el reconocimiento de la importancia de las vitaminas del
complejo B en el crecimiento de las plantas.
En 1934, Gautheret cultivó células de cambium de algunas
especies en una solución mineral con glucosa y cloruro de cisteína. Encontró
que dichas células proliferaban por algunos meses y que adicionando vitaminas y
ácido indolacético (AIA) se estimulaba considerablemente su crecimiento. Estos
investigadores junto con Nobecourt, quien reportó en ese mismo año el
establecimiento de un cultivo similar a partir de zanahoria, son los tres
investigadores considerados los pioneros de la técnica del cultivo de células y
tejidos vegetales (Bhojwani y Razdan 1983, Street 1977).
El medio de Nitsch (1951) es esencialmente una
modificación de la solución Knop, una de las primeras soluciones en el cultivo
hidropónico (cerca de 1865). Este medio
fue útil en el cultivo de partes de flores de tomate; la concentración de
sacarosa utilizada era de 5% en lugar de 2% ó 3% utilizado en muchos otros medios.
El medio de Brauen et al. (1962) es un medio de White
modificado, ya que contiene 845 mg/litro de KCI, 1800 mg/ litro de NaNO3,
300 mg/litro de NaH2PO4.H2O y 790 mg/ litro de
(NH4)2SO4, además de los que se encuentra en
un medio (mineral) basal de White. También se añaden algunos suplementos
orgánicos, por ejemplo la glutamina y la asparagina, y los dos nucleótidos
ácido cítidílico y ácido guanílico; el inostol también está presente (100
mg/litro).
El medio revisado que propusieron Murashigue y Skoog es
esencialmente una modificación de la fórmula basal original de White, a la que
se añadieron 1650 mg/litro de NH4NO3 al igual que 170
mg/litro de KH2PO4. El CaCl2 remplazó al Ca
(NO3)2; por consiguiente, este medio es de alta salinidad
y puede esperarse que sustente el crecimiento de ciertos cultivos que requieren
concentraciones más altas de iones.
II.
DEFINICIÓN DE PROBLEMA
y manejo adecuado de estos.
III.
OBJETIVOS
3.1
Objetivo general
1. Conocer la forma de preparación de los medios
de Murashigue y Skoog y B5 ( o de Gamborg) para el cultivo de tejidos
vegetales.
3.2
Objetivos específicos
2. Conocer y mantener adecuadamente el pH optimo
para el medio de cultivo que será destinado para cultivo de vegetales
3. Conocer cada uno de los procedimientos
necesarios para llevar a cabo la preparación de medios de cultivo
4.
Identificar cada uno de los nutrientes
necesarios para el medio de cultivo
IV.
JUSTIFICACIÓN
La presente práctica se realizó con la finalidad de
realizar medios de cultivo para tejidos vegetales pues el hecho de conocer el
método adecuado y eficaz para llevar a cabo la técnica es de gran importancia.
Cabe mencionar que además la importancia del medio de cultivo consiste en
reconocer e identificar claramente aquellas prácticas y procedimientos que son llevados
a cabo con gran cuidado y manejo higiénico pues este medio de cultivo es
bastante propenso a contaminarse lo cual sería un desastre en cuanto al medio
de cultivo y por ende no podría ser utilizado para el cultivo de plantas. Sin
duda alguna la enseñanza y el conocimiento ya manejado son influyentes pues es
de gran utilidad que el alumno conozca
la perfección cada uno de los procesos llevados a cabo en cuanto a la
preparación de medios de cultivo.
V.
FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo de tejidos
vegetales es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de
cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células
desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas
completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener
plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en
condiciones ambientales controladas.
Casi cualquiera de las
fórmulas salinas basales de las soluciones de cultivo que se tienen actualmente
como estándar debería ser más que suficiente para suministrar un mínimo
esencial de los elementos requeridos. Sin embargo, sería útil ensayar estas
soluciones a diferentes concentraciones totales; por ejemplo, el de Murashige
es un medio relativamente “alto contenido de sal”, mientras el medio de White
generalmente se considera como de “bajo contenido de sal”. Muchos explantes
crecen mejor se les suministra nitrógeno
reducido, lo que se puede hacer agregando sales de NH4+ o suplementando con
urea. El valor medio de MS se atribuye en parte de a sus altos niveles de NH4+
(y de K).
El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho
tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una
técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de
los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como
la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las
instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras
estériles).
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales
de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del
cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).
El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una
porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las
condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su
potencial intrínseco o inducido. Es necesario además adoptar procedimientos de
asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana (Roca
& Mroginski).
A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo,
esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de
plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios
reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de
plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas
en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. (Aceves &
Hernández). Las ventajas que otorga el
cultivo de tejidos son: uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente
para erradicar patógenos. Propagación clonal masiva de plantas libres de enfermedades
en corto tiempo. Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento
de germoplasma en campo. Los materiales pueden ser propagados en cualquier
época del año. Facilita el intercambio de material genético. Reduce el riesgo
de pérdidas genéticas al evitar la mezcla del material por cruzamiento.
Todos los medios parecen beneficiarse en cierto grado con
los suplementos vitamínicos, a menos que las células se vuelvan verdes o hasta
que ello ocurra; los aditivos mínimos usuales son la tiamina, el ácido
nicotínico y la piridoxina. Por consiguiente, los suplementos vitamínicos son
más o menos estándar; en realidad, la tiamina-HCl, como única vitamina añadida,
puede ser suficiente en muchos casos (Linsmaier et al., 1965).
Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o
manipuladas genéticamente, han de propagarse o regenerarse vegetativamente.
Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación
vegetativa para erradicar infecciones por virus y para introducir variaciones
genotípicas que aumenten la calidad de los productos. Estas técnicas se conocen
genéricamente como cultivo in vitro.
Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores
que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes
necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad:
sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar
fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.
El medio inorgánico más empleado es la mezcla
de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con
glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos
de tejidos y células.
VI.
MATERIALES Y MÉTODOS
6.1
Componentes necesarios para preparar medio de cultivo
Componente
|
Cantidad
necesaria para agregar
|
Nitratos
|
3.5 ml
|
Sulfatos
|
3.5 ml
|
Quelatos
|
3.5 ml
|
PoMoBo
|
3.5 ml
|
Halógenos
|
3.5 ml
|
Orgánicos
|
3.5 ml
|
Carbohidratos
(sacarosa)
|
10.5 g
|
Phytagel
|
1.05 g
|
6.2
Material y soluciones necesarias para preparar medios de cultivo
Para llevar a cabo dicha práctica se utilizaron los materiales
y soluciones siguientes: balanza analítica, vaso de precipitado, pipeta,
plancha, frascos, probeta, potenciómetro, soluciones stock
a) b)
Fig. 1- a)
Balanza analítica, b) Vasos de precipitado y pipeta, c) plancha, d) frascos, e)
probeta graduada, f) potenciómetro, g) solución stock
6.3 Procedimiento para preparar medio de
cultivo
Se
pesó en una balanza analítica 10.5 g de sacarosa y de phytagel 1.05,
seguidamente en un vaso de precipitado se agregó cada uno de los componentes
(soluciones stock la cantidad de 3.5 ml igualitariamente), posteriormente se
agregó la sacarosa y por consiguiente se aforo a 350 ml, seguidamente se vació
a un vaso de precipitado para medir el pH de la solución, penúltimamente se
cocino el medio de cultivo calentando a 50°-70°C y se agregó el phytagel y por
último se dejo enfriar un poco el medio de cultivo y se vació a frascos una
cantidad de 25ml
c) d)
e) f)
g) h)
i) j)
k) l)
m) n)
Fig. 2- a)
se tomo 3.5 ml de nitratos, b) se tomo 3.5 ml de sulfatos, c) se tomo 3.5 ml de
quelatos, d) se tomo 3.5 de PoMoBo, e) se tomo 3.5 ml de halógenos, f) se tomo 3.5
ml de orgánicos, g) se agregó la sacarosa, h) se disolvió la sacarosa, i) se
aforo a 350 ml, j)-k) se agrego a vaso de precipitado para medir el pH, l) se
calentó en plancha el medio de cultivo, m) se agregó el phytagel a la solución,
n) se agregó 25 ml a cada uno de los frascos
VII.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios
pues se logro realizar los medios de cultivo con las cantidades exactas de las
soluciones stock para agregar y mezclar, aunque antes de todo lo primero que se
realizo fue llevar a cabo cada una de los cálculos para poder conocer la
cantidad exacta de soluciones stock, sacarosa y phytagel que se debía pesar y
diluir.
7.1 Calculo
se soluciones Stock para medio de cultivo
1.
Preparar 350 ml de solución stock para
medio de cultivo a una concentración de 100x
CALCULOS
A REALIZAR
Para
componentes de medios de cultivo (soluciones stock)
V1C1= V2C2
V2= V1C1
= 350 ml . 1x =
350 ml = 3.5 ml
C2 100 x 100 x
|
Componente
|
Calculo
realizado
|
|
Nitratos
|
3.5 ml
|
|
Sulfatos
|
3.5 ml
|
|
Quelatos
|
3.5 ml
|
|
PoMoBo
|
3.5 ml
|
|
Halógenos
|
3.5 ml
|
|
Orgánicos
|
3.5 ml
|
Para sacarosa
CALCULOS
A REALIZAR
30 g ---------------- 1 L =
1000 ml
x? ------------------- 350 ml
30 g (350 ml) 10, 500 g/ml
------------------- =
--------------- = 10.5 g
1000 ml 1000 ml
Para phytagel
CALCULOS
A REALIZAR
2.7 g
---------------- 1 L = 1000 ml
x? -------------------
350 ml
2.7 g (350 ml) 1050 g/ml
------------------- =
--------------- = 10.5 g
1000 ml 1000 ml
7.2 Procedimiento realizado para
preparar medio de cultivo (M & S)
Lo primero que se realizó fue pesar con ayuda
de una balanza analítica la sacarosa (10.5 g) y phytagel (1.05 g),
posteriormente con ayuda de una pipeta se tomó 3.5 ml de cada una de las
soluciones stock para agregarlas en un vaso de precipitado, una vez que se
termino de mezclar las soluciones se agregó la sacarosa, una vez que esta fue
completamente diluida se aforo a 350 ml en una probeta graduada, seguidamente
fue vertido a un vaso de precipitado para medir el pH en el que si la solución
marcaba un rango menor a 5.7 se agregó un ácido y si el rango era superior a
6.0 se agregaba una base, para este caso el pH marcado era ácido por lo que se
opto por agregar una base para mantenerlo a un pH igual a 5.7 o mayor y menor
de 6.0, una vez que el pH fue medio de cocino el medio a una temperatura de
50°-70°C y se agregó seguidamente el phytagel poco a poco con el fin de que se
formase bolas de phytagel, una vez agregado todo el phytagel se dejo hervir
durante 1-2 minutos y se dejo enfriar para finalmente agregar 25 ml del medio
de cultivo a los 14 frascos.
p)
Fig 3. –a) se tomó 3.5 ml de nitratos, b) se tomó
3.5 ml de sulfatos, c) se tomó 3.5 ml de quelatos, d) se tomó 3.5 ml de PoMoBo,
e) se tomó 3.5 ml de halógenos, f) se tomó 3.5 ml de orgánicos, g) se agregó la
sacarosa, h) se disolvió la sacarosa, i) se aforó a 350 ml, j) los 350 ml de
solución fue vaciado a vaso de precipitado, k) se medio el pH el cual al
principio fue de 3.98 lo cual indicaba una solución ácida, l) nuevamente se
midió el pH pero agregando la base para mantener el rango optimo que en este
caso lo fue de 5.72, m) se cocinó el medio de cultivo, n) se agregó el
phytagel, ñ) al agregar el phytagel poco a poco se disolvió bien, o) se dejo
enfriar muy poco, p) se vació a frascos la cantidad de 25 ml
VIII.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El medio de cultivo es un conjunto de
ingredientes que otorgan los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de
plantas cultivadas in vitro.
El conocimiento y manejo adecuado de cada uno
de los procedimientos para realizar un medio de cultivo es de importancia para
no obtener errores en cuanto a los requerimientos de las plantas.
El conocer y saber realizar cálculos
correctos para conocer la cantidad exacta de constituyentes para cierto volumen
de medio de cultivo es importante para no tener errores en cuanto a cantidades.
El medio de cultivo y por ende el
cultivo de explantes vegetales es de
gran importancia en cuanto a la biotecnología y la industria, pues por medio
del cultivo in vitro se pueden
obtener masivas propagaciones de plantas.
El medio de cultivo más utilizado y eficaz
para la mayoría de las plantas fue el que dio a conocer Murashigue & Skoog.
Se debe de tomar en cuenta que si no se
tienen los conocimientos previos y la eficacia de realizar cálculos para
obtener cantidades exactas es un problema pues la deficiencia de alguno de los
ingredientes que conformen el medio de cultivo se verá reflejado en el explante
de planta que se pretenda cultivar.
Se debe de tener buenas prácticas y
conocimientos sobre cómo manejar los medios de cultivo ya que estos están
expuestos a contaminarse.
El uso de buenos espacios para realizar el
manejo y preparación de medios de cultivo, hacen de alguna manera la práctica
más eficaz.
El conocimiento adecuado sobre el manejo de
ciertos equipos de laboratorio utilizados para la preparación de medios de
cultivo contribuye a realizar una práctica más rápida, sencilla y sin errores
IX.
FUENTES CONSULTADAS
A.D.
Krikorian. Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Componentes
del medio de cultivo. E. U.
Graciano
Calva Calva & Josefina Pérez Varga.
2005. Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el
futuro. http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/nov_art104a.pdf
L. A. Mroginski & W. M. Roca. Medios de cultivos de tejidos vegetales in
vitro. Medios de cultivo: componentes
W.M. Morgan.
Cultivo de tejido vegetal. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf
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