09/02/12
UNIDAD II CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
2.1 MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo de tejidos es una tecnica que consiste en aislar
una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las
condiciones fisicas y quimicas apropiadas para que las células expresen su
potencial intrinseco o inducido. es necesario ademas adoptar procedimientos de
asepsia para mantener los cultivos libres de contaminacion microbiana.
Estos principios son básicamente invariables en todos los
laboratorios de cultivo de tejidos vegetales, su aplicación puede presentar
variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del
laboratorio.
El laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un area destinada al establecimiento,
crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta area es especialmente
necesaria en los laboratorios de investigación y desarrollo.
literatura citada
puche a., f. y rodriguez p., l. 2000. curso-taller
cultivo de tejidos vegetales. ita-25-dgeta. México. 152 p
09/02/12
2.1.1 ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS
Un laboratorio de cultivo de
tejidos se puede dividir esquemáticamente
en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en el las áreas principales son:
1. área de preparación. se utiliza
principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también
un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico, y los
reactivos químicos. este ambiente debe de contar con mesas de trabajo para la preparación
de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos
calientes con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías
y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de
crecimiento.
2. área de lavado y de esterilización. Puede estar constituida por dos
ares conectadas entre sí, o por un solo ambiente, y puede estar localizada
dentro del área general de preparación.
El área de lavado debe
incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una
fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente
destilada; para el efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no
toxico y un desionizador de agua colocado entre el destilador y el lavadero. Esta
área debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico;
también debe proveer basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y
de vidrio que se deseche.
El área de esterilización de
be tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser
pequeño (olla de presión) o grande de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido,
según sea el volumen del material que se procese. Esta área también puede
incluir espacio para estufas, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.
3. área de trasferencia. En esta
área del laboratorio se realiza el trabajo de excision, inoculación y
trasferencia de los explantes a los medios de cultivo.
4. área de incubación. Los cultivos
se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento. El área
de incubación o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la
temperatura (20-28 c), de la iluminación (variable, según las necesidades: 1000
a 5000 lux) y de la humedad relativa (70-80 porciento).
En el cuarto de incubación se
instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos. Estas estanterías
pueden tener dimensiones variables: el ancho entre 0.30 M y 1.00 m, el largo de
acuerdo con el tamaño del cuarto, y la altura total de i.80 a2.20 m; la
distancia entrepaños es de 0.20 a 0.50 M.
Esta área debe incluir, además,
un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad.
5. área de observación y
examen. Generalmente los microscopios (estéreo, compuesto, invertido y otros)
se localizan tanto en el área de incubación como en la de transferencia, pero
opcionalmente pueden estar en un área separada. El objetivo de esta área es
realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como
en líquidos.
6. área de crecimiento. Las plantas
que se regeneran en el área de incubación se pueden acondicionar o aclimatar y
luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Estas operaciones se
pueden llevar a cabo en tinglados, casas de malla o invernaderos, dependiendo
de las condiciones climáticas del lugar donde está ubicado el laboratorio y de
los requerimientos de aislamiento de los materiales por razones fitosanitarias.
Después del trasplante, las
plantas generalmente necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones
de campo, lo cual se puede lograr usando nebulización cámaras húmedas de plástico
etc.
7. áreas de cuarentena y de
control fitosanitario. Esta área de cuarentena debe estar separada del resto
del laboratorio pero cercana al área de control fitosanitario.
En el área de control
sanitario se realizan las pruebas necesarias para comprobar la sanidad del
material vegetal, especialmente de enfermedades causadas por virus, bacterias y
hongos.
8. área de oficina. En esta área
se deben ubicar el mobiliario de oficina como escritorios, archivos y
almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio,
los catálogos y otros documentos.
literatura citada
puche a., f. y rodriguez p., l. 2000. curso-taller
cultivo de tejidos vegetales. ita-25-dgeta. mexico. 152p
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2. 1. 2. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
CRISTALERÍA
La
cristalería de uso más común para el cultivo de tejidos se selecciona de la que
se utiliza en experimentos químicos o de microbiología; sin embargo, poco de
este material está diseñado especialmente por investigadores. Se utiliza
bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la
siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deberá ser de alta
calidad, resistente a altas temperaturas y a ácidos y no liberar sustancia
alguna, especialmente aquélla que es utilizada en la conservación de soluciones
madres.
TUBOS
DE ENSAYO
Se
utilizan muy frecuentemente en cultivos con pequeñas cantidades de soluciones o
bien para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotación o
en agitación, para los medios líquidos, se utilizan tubos de ensayo, así como también
en los medios sólidos. Los tubos de ensayo utilizados para cultivo de tejidos
son más cortos y más anchos. Normalmente las dimensiones de los tubos de ensayo
son de 2.0 x 15.0 cm, 2.5 x 15.0 cm o de 2.5 x 9.0 cm, aunque en el cultivo de
órganos (experimentos sobre inducción de órganos) a partir del cultivo de
tejidos y en la inducción floral se emplean tubos específicos que son de mayor
longitud y diámetro (2.5 x 20.0 cm). Para cubrir la boca los tubos de ensayo,
una vez que se les ha cultivado, se usan los materiales siguientes: algodón no
absorbente, papel aluminio o de poliestireno, poliestireno K-resina, tapas de
plástico, tapones de hule y de polipropileno.
MATRACES
ERLENMEYER
Estos
matraces se usan para preparar medios de cultivo sólidos o líquidos; en la
preparación de medios de cultivo. Se usan matraces de capacidad de 50, 125, 300
y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de trabajo, se tendrá la
cantidad requerida de matraces. Para cultivo en matraces son más fáciles para
su manejo los de 50 y 125 ml de capacidad; cuando los matraces y los tubos de
ensayo tienen un mismo diámetro, se facilita más el hacer tapones para
cubrirlos. Un diámetro de 25 mm es suficiente para operar dentro de ambos.
Aunque por supuesto, en el cultivo masivo de tejidos, tanto en medio sólido
como líquido, se requieren dimensiones más grandes en los matraces.
CAJAS
DE PETRI
Las
cajas de petri no sólo se utilizan para hacer cultivos en medios sólidos,
también para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de
hule, filtros de nylon o de acetato de celulosa, que se usa para esterilizar
soluciones orgánicas e inorgánicas y para guardar papel filtro.
Comúnmente
se utilizan cajas de petri de 6, 9 y 12 cm de diámetro. Para la germinación de
semillas son más convenientes las de mayor anchura. Estas cajas de petri
deberán tener un ajuste firme entre la tapa y tapa. Generalmente se emplean
cajas petri de vidrio, aunque en la actualidad se están fabricando de
polipropileno. Estas son deshechables.
BOTELLAS
PARA CULTIVO
Para
propósitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas
cilíndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy,
etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para
los medios de cultivo sólido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede
conservar fácilmente en una posición vertical u horizontal. Las botellas
cuadradas pueden colocarse unas sobre de otras, de tal forma que no ocupen
mucho espacio, y las cilíndricas no requieren de canastillas especiales para
guardarse. Uno de los recipientes más empleados para el cultivo de tejidos es
el frasco para alimento de bebes (Gerber) que aparte de ser útil, es fácil de
conseguir, muy barato y no ocupa mucho espacio en la cámara de incubación. En
algunas casas comerciales pueden conseguir recipientes de polipropileno o de
policarbonato, que además de ser práctico requieren de poco espacio; sin
embargo, tienen el inconveniente de tener un costo alto. La condición más
favorable es tener el costo más bajo posible tanto en lo referente a
investigación, enseñanza y obviamente cuando desarrollamos tecnología para
fines comerciales.
Se
requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para
guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las
botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicación de hongos y bacterias
o oxidación causadas por la luz. Las botellas de polipropileno como se utilizan
para conservar bajo congelación compuestos de composición indefinida, como el
agua de coco, soluciones hormonales o compuestos orgánicos termoinestables.
PIPETAS, GOTEROS, PROBETAS Y MATRACES
Para
la preparación de diversas soluciones para la elaboración de los medios básicos
para el cultivo de tejidos vegetales se requiere de la cristalería siguiente:
Pipetas graduadas: de 1, 2, 5 y 10
ml
Goteros con pera de goma de 10 ml
Probetas graduadas: de 25, 50, 100,
250, 500 y 1000 ml
Matraces volumétricos: de 500 y 1000
ml
Matraces aforados: de 50, 100 y 250
ml
VASIJAS DE VIDRIO PARA LA DISTRIBUCIÓN DE
MEDIO DE CULTIVO
Para
la distribución de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes
formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y
pinzas de compresión, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de
inyección de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras. Cuando
por alguna razón no se cuenta con los accesorios adecuados para servir el medio
de cultivo, como improvisación se usa el embudo grande de vidrio con tubo de
hule en el extremo del tallo y pinzas de compresión para controlar el volumen
de salida del medio de cultivo.
JERINGAS DISPENSORAS
Cuando
son volúmenes pequeños de medios de cultivo es muy efectiva la pipeta
automática del tipo Cornwall. Esta pipeta está diseñada especialmente para el
traspaso automático de dosis repetida de mediciones exactas y con capacidad
para 10 ml.
FILTROS Y ESTERILIZADORES
Para
la esterilización del aire y líquidos se emplean filtros especiales. Uno de
estos es el cilindro de diatomeas que es usado para líquidos y consta de una
abrazadera y un matraz conectado a un extractor. El filtro más famoso es el
Seitz y es usado para esterilización del aire del cuarto aséptico, el cual esta
conectado a una compresora de aire.
Resientemente
se han usados membranas de éstercelulosa para propósitos de esterilización de
líquidos. Se tienen muchos tipos de membranas de acuerdo al tamaño de los
poros. Para esterilización se deben escoger aquellos que tengan poros de menor
tamaño que 0.25 micras. Estas membranas se consiguen en el mercado con el
soporte y otros aparatos adaptables. Se les conoce bajo varios nombres como:
Filtro Millipore, Filtro Galman de membrana, Filtro Toyo de membrana, etc.
Normalmente
estos filtros se pueden esterilizar en autoclave a una atmósfera de presión
durante 15 min., la esterilización por más tiempo o esterilización seguidas no
afecta la membrana. Se sugiere que al utilizar estos filtros de membrana se
sigan las recomendaciones indicadas por los fabricantes.
CÁMARA DE FLUJO LAMINAR
Para
la realización de investigación y docencia en un laboratorio de cultivo de
tejidos se requieren condiciones de asépsia, por lo que se emplea la cámara de
flujo laminar que inyecta el aire ultrafiltrado y esterilizado que permita la
manipulación de los tejidos sin que se presenten problemas de contaminación por
microorganismos como hongos y bacterias, no solamente cuando se hace la
inoculación, sino cuando se sirve medio de cultivo a frascos que, por motivos
de la técnica, se tengan que esterilizar previamente. De acuerdo al flujo del
aire, las cámaras son horizontal o vertical y se tienen tres presentaciones, en
cuanto al tamaño; 0.60m, 1.20 m y 1.80m. Algunas veces se encuentran
complementadas con llave para gas y para extracción de aire (vacío).
HORNOS PARA SECADO
Estos
hornos se usan especialmente para el secado del material de vidriería lavado y
para la esterilización de instrumentos usados para el cultivo. Para la
esterilización por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140°C
durante 4h o bien a 150°C – 180°C por una hora, por lo que se requiere de un
termostato que sea preciso. Sin embargo, la esterilización por este proceso no
es recomendable para cristalería de medición de precisión, como probetas,
pipetas, debido a que el vidrio sufre dilatación por el calor, lo que altera
los volúmenes que se miden.
Las
pesadas en seco de células o tejidos cultivados se hacen después del secado al
vacío en un horno de vacío. Para este propósito muchas compañías venden
eléctricos de vacío con termostato.
AUTOCLAVES
Las
autoclaves esterilizan con vapor de presión y tienen dos sistemas de
calentamiento: a base de gas o de electricidad. Los modelos de autoclave son de
tipo horizontal o vertical.
La
esterilización de algodón, gas, papel para envoltura (aluminio, manila),
filtros Seitz, millipore, pipetas probetas, matraces aforados, agua y medio de
cultivo se hace en autoclave.
REFRIGERADOR Y CONGELADOR
Células,
tejidos y soluciones madres, se deben de conservar a bajas temperaturas y para
ello se requiere un refrigerador. Por otro lado, algunas de las vitaminas o
compuestos de composición química indefinida, como el agua de coco, requieren
de ser mantenidas en congelación, sobre todo en aquellos lugares de clima
cliente. Para experimentos en pequeña escala, un refrigerador común con un
pequeño congelar es suficiente.
BALANZAS
La
preparación del medio requiere de realizar el pesaje con precisión de todos los
componentes que lo integran con precisión y de acuerdo al tipo y a la cantidad
del constituyente que se agregue al medio, así será el tipo de balanza que se
emple. Existe una gran diversidad de este equipo, sin embargo, hay dos tipos de
balanza que son muy usuales en el laboratorio: granatarias y analíticas, ambas
de precisión
TORSIÓN O GRANATARIA
Las
balanzas granatarias más frecuentes son:
De
doble y triple barra
Electrónica
con platillos superior
Las
balanzas de torsión tienen una capacidad de 100 a 200 g, y sirven para pesar en
gramos de sustancias químicas o células
cultivadas. La precisión de 0.1g, es suficiente para estos experimentos.
BALANZAS ANALÍTICAS
En
el mercado se tienen diferentes modelos, sin embargo, por lo menos existen 3
tipos de aparatos:
-
De platillo metálico, cuyo sistema de pesaje depende de material de cuarzo
-
Electrónica con platillo fijo en el interior del equipo
-.Electrónica
con el platillo en el exterior del aparato
Estas
balanzas tiene una capacidad de 100 a 160g, y una precisión de 0.1mg, lo cual
es muy útil para pesar cantidades pequeñas de hormonas, vitaminas y otros
microelementos.
CUIDADOS
Para
lograr un pesaje adecuado sobre todo exacto, se deben observar algunas
precauciones indispensables para su buen funcionamiento, como son:
- Las balanzas deben estar colocadas
sobre una mesa estable, dura y nivelada que impida que las vibraciones y
corrientes de aire afecten las pesadas.
- Deben estar ubicadas en un lugar
limpio
- Nunca deben estar sobrecargadas
- Nunca debe pesarse directamente sobre
el platillo; para tal efecto hay que emplear recipientes ligeros o papel.
- Checar continuamente que la balanza
este nivelada. En el caso que no lo esté, centrar la burbuja con el nivel del
aparato.
- Evítese desplazarlas del lugar donde
fue ubicada en el área de balanzas, de manera que no se afecte su mecanismo.
MEDIDORES DE pH
Para
ajustar el pH de los medidores de cultivo se utilizan indicadores de papel y
químicos, pero lo más conveniente es usar un potenciómetro con electrodos de
vidrio. El potenciómetro no sólo se usa para medir el pH de los medio al
prepararse, sino también para medir el pH de los medios durante el período de
incubación. Recientemente se usan aparatos con control automático de pH para
los cultivos en suspensión.
DESTILADOR
El
agua exenta o con una cantidad mínima de metales pesados es una condición
primordial en el cultivo de tejidos vegetales, Muchos investigadores utilizan
agua bidestilada o tridestilada, hecha en destiladores de vidrio de alta
calidad o bien combinado el proceso de destilación por ósmosis inversa y
desmineralización. La preparación. La preparación de soluciones madre, medios
de cultivo, lavado de cristalería, etc., requiere de grandes cantidades de agua,
por lo que es necesario tener un destilador grande de metal, tomando en cuenta
que el agua obtenida así, contiene una
pequeña cantidad de iones de metales pesados, condición que afecta el
desarrollo de las células en cultivo. Para la obtención de agua también se
puede usar un desionizador después de haberse obtenido el agua en un destilador
metal.
Adicionalmente,
si se necesita agua completamente exenta de sales, se debe redestilar en su
destilador de vidrio de alta calidad.
AGITADOR MAGNÉTICO
Este
es un aparato fundamental para la preparación de los medios de cultivo. Su uso
permite la mezcla de los constituyentes del medio durante la elaboración de las
soluciones madre o bien en la preparación del medio definitivo. También existen
diversos modelos, pero su funcionamiento se limita a dos aspectos, agitar, lo
cual permite mezclar el soluto con el solvente y con sistema de calentamiento,
lo que facilita la disolución de algunos compuestos que requieren calor para
entrar en solución. El número de revoluciones oscila entre 60 hasta 1800 rpm.
El número de plazas varia de acuerdo al modelo, pero los hay desde un espacio
hasta 6.
Complementariamente,
se emplean barras magnéticas que son las encargadas de realizar la agitación de
las substancias. Las hay de diferente tamaño y diámetro; con o sin costilla.
literatura citada
puche a., f. y rodriguez p., l. 2000. curso-taller
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2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO COMPOSICIÓN GENERAL
Compuestos inorgánicos
Macronutrientes: NO3- ,
PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42-
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+,
Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-
Carbohidratos
Sacarosa, glucosa,
mio-inositol
Vitaminas
Tiamina (B1)
Piridoxina
Acido nicotínico (C)
Biotina
Aminoácidos
Glicina
Reguladores del crecimiento
Auxinas
Citocininas
Giberelinas
Soporte inerte (medios
semisólidos)
Agar (0,7 a 1%)
Gelrite
pH
5,6 – 5,8
Esterilización
1 atmósfera, 15 a 20 minutos
en autoclave
Formulación básica
de un medio de cultivo para tejidos vegetales
•
Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
•
Soluciones
concentradas de microelementos (100x)
•
Vitaminas
grupo B (500 ó 1000x)
•
Mio-inositol
(100 mg/L)
•
Azúcares:
Generalmente sacarosa o glucosa
en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.
•
Agar-agar:
hidrato de carbono de alto peso
molecular extraído a partir de algas. Se usa
entre
5 y 10 g/L
Propiedades físicas de los medios de
cultivo
Consistencia del medio Semisólido
Líquido
•
El metabolismo de los tejidos puede modificarse
dependiendo de las características del medio
de cultivo
(líquido o semi-sólido).
•
En el caso de
un medio sólido, la concentración y calidad
del agar pueden tener importantes efectos en
el desarrollo
del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento
lento, etc.).
•
El cultivo en
medio líquido resulta imprescindible cuando
la propagación in vitro es
desarrollada a través
de las siguientes vías:
- Inducción de embriogénesis*.
- Cultivo de protoplastos.
-
Cultivo de suspensiones celulares.
Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo
se tapan con una película de polietieleno (Resinite) para posibilitar el
intercambio de gases. La organogénesis
puede verse modificada si el
intercambio de gases se ve dificultado.
- La inducción de yemas a
partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente
oxígeno.
- La acumulación de etileno
puede inhibir
la regeneración de brotes.
pH:
- Constituye un factor crítico.
- Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8.
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.
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2.1.4. COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO
Componentes
de un medio de cultivo:
- Sales
inorgánicas
- Fuente
de
- Reguladores
de crecimiento
- Vitaminas
- Aminoácidos
- Complejos
- Reguladores
de crecimiento vegetales
- Antioxidantes
- Material
de soporte
- Agua
El
éxito de la aplicación de la tecnología del cultivo de tejidos in vitro depende
del grado de entendimiento de los requerimientos nutrimentales que tienen las
células, tejidos u órganos. No obstante, el éxito o fracaso está relacionado
con el origen o naturaleza del inóculo (meristemos, embriones, raíces, anteras,
hojas, ovarios, protoplastos y células en suspensión, callos y endospermo).
Haberllandt
(1902) estudió el efecto de los componentes inorgánicos en el crecimiento del
girasol y tejidos tumorosos de tabaco; Burkholder y Nickell (1949) el efecto de
los iones inorgánicos en agallas de acedera y Nitsch y Nitsch (1956-1957)
muestran que las sales inorgánicas reducen el crecimiento del girasol
tuberoso remolacha azucarera, De
acuerdo a los efectos mayores o menores que causen en los tejidos, podemos
distinguir que un medio de cultivo está formado por componentes esenciales y no
esenciales. Se consideran esenciales a la mezcla de compuestos químicamente
definidos y que se ha denominado como medio basal o sintético y está
constituido por una parte inorgánica y otra orgánica; los elementos inorgánicos
combinan macroelementos con microelementos
y la parte orgánica está formada por una fuente de carbono y energía,
vitaminas aminoácidos y reguladores del conocimiento. Adicionalmente se emplean
compuestos naturales de composición no definida y sustancias anitoxidantes.
NUTRIMENTOS INORGÁNICOS
Los minerales son muy importantes en
la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la
presencia de compuestos inorgánicos que se agrupan en macro y micronutrimentos.
Micronutrimentos
Son los que se requieren en
cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad,
(carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y
ácidos nucleicos.
Comúnmente
se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se
añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles
(Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de
fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede
detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se
agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch
y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se
encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por
resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la
molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la
membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos
deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se
adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y
menos comúnmente como fosfato tricálcico ( Ca 3
PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la
forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio
y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen
crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando
la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La
concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración
absoluta de iones.
Micronutrimentos
Los
micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los
elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn),
cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la
estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés
bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen
en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et
al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto
con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde
interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De
acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas
peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células
vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número
de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración
puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954).
En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas
enzimáticos (Hewitt, 1948).
El
zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical
del jitomate (Eltinge y Reed, 1940). Cobre forma parte de enzimas oxidasas que
están involucradas en la oxidación e hidroxidación de compuestos fenólicos,
ácido abscísico y dopamina (Lerch, 1981). El fierro y molibdeno juntos forman
parte de la estructura de las enzimas nitrogenasa y nitrato reductasa (Lerch,
1981). Algunas veces el Zn se añade con un quelato (EDTA).
El
boro tiene su efecto más importante en inducir el crecimiento del tejido
diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro
frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la
deficiencia propicia una depresión de las citocininas lo que trae como
consecuencia un incremento en la concentración endógena de las AUXINAS y de tal
manera que en un sistema de raíz deficiente de boro, aparentemente hay una
inhibición de la raíz por un exceso de auxina (Odhnoff, 1957, Whittington,
1959).
El
cobalto se encuentra en la estructura de análogos de la vitamina B₁₂ que es
involucrada en la síntesis de los ácidos nucleicos (Fries, 1962). El fierro es
requerido para la formación de ácido aminolevulínico y protoporfirinógeno que
son precursores temprano y tardío de la clorofila, respectivamente; además es
un componente de las proteínas ferredoxinas cuya función es como transportador
de electrones en fotosíntesis.
El
fierro se usa como FeSO4 o FeCl2, pero en valores
superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)2, tal como ocurre en
el cultivo de raíz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro. En el
cultivo de tejidos no se observó deficiencia de Fe, por lo que algunas
sustancias, como quelatos pudieron penetrar en las células.
El
tartrato férrico a pH 6.0 y el EDTA-Fe a pH 7.2 son en la forma en que se les
usa. En medios líquidos, el citrato férrico o el tartrato férrico es utilizado
en lugar del FeCl₃. Recientemente investigadores utilizan el Fe en forma de citrato,
tartrato o de EDTA-Fe.
En
los inicios de los experimentos del cultivo de tejidos, fue incierta la
naturaleza de los micro elementos esenciales; sin embargo, Knudson (1922)
incorpora el Fe y Mn exitosamente para la germinación de semillas de orquídeas
no simbióticas. Otros elementos menores agregados al medio Nobecourt (1937)
fueron Cu, Co, Ti, y Be. Heller (1953) observa la deficiencia de los minerales,
en callos de zanahoria previamente crecidos en medio Gautheret, causa la muerte
del tejido, cuando se hacen 3 a 5 transferencias a un medio sin Fe, B, Mn, Zn o
Cu. En el cuadro 1, se presenta la concentración de los componentes, tanto
macro como micronutrimentos, de diferentes medios de cultivo.
Complementos orgánicos
Se
consideran complementos microorgánicos a los compuestos orgánicos que se han
llamado así por que el crecimiento y en general la morfogénesis se ven
mejorado.
Los
complementos microorgánicos se agrupan en:
Vitaminas
Aminoácidos
Complejos naturales de composición
química indefinida
Reguladores del crecimiento
Vitaminas
Las
vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos
por los animales en pequeñas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que
normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su
crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Cuando
las células de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son
necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de
concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán
de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del
medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina,
ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.
Generalmente,
los requerimientos de las células, tejidos u órganos vegetales de vitaminas,
son cubiertos por la adición externa, sin embargo, los tejidos pueden
obtenerlas a partir de los complejos orgánicos de composición indefinida como
en agua de coco, extracto de levadura, jugos de frutas, aguamiel. Aún cuando
las plantas in situ son capaces de sintetizar sus propias vitaminas-Butenko
(1986) menciona que tejidos de zanahoria pueden llegar a habituarse.
Tiamina (B1)
La
Tiamina es esencia para el crecimiento.
Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en
pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de
sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la
naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones
relativamente elevada.
Piridoxina (B6)
Es
termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera
esencial para la mayoría de las plantas in vitro.
Quizá
el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de
purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.
Acido nicotinico
También
se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal función es ser
coenzima de las enzimas que se conoce
como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP
Y NADH o NADPH).
Riboflavina
Es
termoestable, pero fácilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones
(90.01 mg.l-l) promueve el crecimiento en callos habituados de
zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l-1 inhiben completamente el crecimiento en la
luz y promueve el crecimiento en la oscuridad (Butenko, 1968). La riboflavina
aparece en la naturaleza como un constituyente de las flavinas coenzimas:
flavin mononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucleótida (FDA). La riboflavina
es termoestable por lo que no se descompone fácilmente (cuadro 1-3). Galston,
Bonner y Baker (1953) señalaron que las diferencias de crecimiento en la luz y
oscuridad de brotes blanquiscos o etiolados de chícharo eran causados por la
activación del AIA por la riboflavina.
Acido pantotécnico
Es
termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el
medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorón y
Juniperas (Morel, 1946; Gautheret, 1958). Se encuentra en la naturaleza como
componente de la coenzima A. Sin embargo, no es una vitamina esencial.
Biotina
No
es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inóculo de
sauce llorón (Gautheret, 1959). La biotina sirve como factor de crecimiento de
las levaduras y algunas bacterias. Unida a su enzima específica, se relaciona
íntimamente con reacciones de carboxilización.
- carboxilación
- carboxilación conjugada y
transcarboxilación
Acido fólico
No
es esencial y se descompone con el calor en soluciones ácidas. En la oscuridad
inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve.
Reinert y White (1956) mostraron que el ácido fólico inhibe el crecimiento de
tejidos de pino. Se considera como vitamina en función de coenzima.
Aminoácidos
Los
aminoácidos representan, para las células, una fuente efectiva e inmediata de
nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que
el nitrógeno inorgánico, aún cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo
medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es
bastante discutido. Es conocido que su empleo esta en función del balance
adecuado de la relación NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4,
NO3, NH4Cl, etc. Generalmente la inclusión de estos compuestos nitrogenados
orgánicos es necesaria solamente cuando se inicia la formación de callo, se
consideran como estimulantes o requeridos
durante la proliferación celular (Gamborg y Jerry 1981). Tienen efecto
notable sobre el desarrollo de tejidos vegetales cuando son usados en
combinación, mientras que empleando uno solo no se muestra afecto. Alguno tiene
efecto antagónico entre ellos, así es el caso de la fenilalamina y tirosina
(Anderson, 1976), la leucina y valina, la isoleucina y valina , la arginina y lisina
sobre el crecimiento de raíz del embrión de la avena bajo cultivo. En tejido de
tabaco el efecto antagónico se observa con la isoleucina, valina y treonina.
Los aminoácidos son usados como
constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por
adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona,
triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina,
etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina,
L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina,
L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957)
señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo
de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. Además, las formas
racémicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de
aminoácidos. Se han señalado efectos diferentes al usar isómeros de
aminoácidos, por ejemplo: -L alanina es más fácilmente asimilado que la
B-alanina. El ácido α aminobutírico no puede ser utilizado como fuente de nitrógeno, pero puede remplazar
completamente a los nitratos.
La inhibición del crecimiento por
algunos aminoácidos sólo ocurre por causa de inhibición sintética del nitrato
reductasa. Este crecimiento puede ser recuperado usando arginina como el
aminoácido desnhibidor, la arginina tiene también efecto de restablecer el
crecimiento de raíces inhibidas en compuestas; además de acelerar la formación
de yemas en tejidos de tallo de tabaco. La urea también puede ser usada como
una fuente de nitrógeno, en vez de aminoácidos. Aún cuando la mayoría de los
investigadores señalan que si el medio de cultivo tiene la fuente de amonio o
nitrato adecuado, los aminoácidos no son esenciales (Gamborg, et. al.,1976).
También es cierto que la adición posiblemente depende del origen del tejido;
además de que su incorporación es requerida para diversos objetivos. De acuerdo
con Steward y Caplin (1951), la glicina o mezcla de aminoácidos en forma de
caseína hidrolizada se requieren para el mantenimiento de células
indiferenciados (callo). Murashige y Skoog (1962) Gamborg (1966) señalan que la
adición de la caseína hidrolizada incrementa la división celular en tabaco,
frijol y maíz, respectivamente. Nitsch et. al. (1970) confirma que agregar nitrógeno
en forma de NH₄⁺ estimula el crecimiento de callo en pera o manzana; pero
aumenta cuando el medio se complementa con asparagina, glutamina u otro
aminoácido.
A pesar de que la presencia de nitrógeno
orgánico es muy importante para la organogénesis, se considera esencial para la
embriogénesis. Además de la caseína hidrolizada, la L-glutamina ha demostrado
ser promotor del desarrollo embrionario. En ocasiones, puede sustituir a la
caseína hidrolizada (Litz, 1982). Filner (1978) indica que en células XD de
tabaco, el nitrógeno orgánico, particularmente la arginina actúa positivamente
en la síntesis de proteínas. En embriones inmaduros de vainilla, el
aceleramiento de la maduración es estimulada por la adición al medio de sulfato
de adenina y L-glutamina (Parra y González, 1989 y González et. al. 1990)
Es
difícil definir si el papel de los aminoácidos es esencia o no; sin embargo, la
adición de la caseína hidrolizada puede prevenir o inclusive asegurar la fuente
de nitrógeno, ante la posible deficiencia de la fuente de amonio o nitrogeno
inorgánico o como Li et. al., (1989) señala que la ausencia de aminoácidos,
principalmente prolina, ocasiona degeneración de plántulas de Pachystachys
lutea cultivadas in vitro.
Carbohidratos
La sacarosa y la glucosa se utilizan
en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa,
rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de
tejidos. Para la mayoría de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente
de carbohidratos (2-5%), de manera que el máximo aumento en peso fresco en los
tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el
máximo de peso seco a 8%. Varios informes señalan que la sacarosa se hidroliza
activamene a fructuosa y glucosa por la invertasa de la pared celular. Así por
ejemplo, la sacarosa, callosidades de zanahoria, desaparece del medio de
cultivo en dos días. La dextrina, pectina y almidón son aprovechados por la
callosidades de Sequoia y el almidón soluble es aprovechado por callosidades
del endospermo del maíz o de Juniperus. Las carbohidrasas hidrolizan el
almidón, maltosa o rafinosa en monosacáridos.
La combinación de algunos
carbohidratos no son útiles para el crecimiento de tejidos vegetales como
fuente única de carbono. Los ácidos orgánicos más efectivos, como el ácido
succínico, ácido cítrico y ácido fumárico, desarrollan sólo de un 25 a 50% del
crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono
es la sacarosa Bouriquet (1958) sugiere que los ácidos orgánicos actúan
sinergéticamente a bajas concentraciones del 2,4-D.
Reguladores del crecimiento
Los
reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y
retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintéticas.
Auxinas naturales
De
acuerdo con su naturaleza, el ácido indolacético (AIA) es la única auxina
natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de
ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo
en suspensión. Por ser hormona natural, su desaparición del tejido es muy
rápido ya que en las plantas se encuentran las enzimas oxidasas de la que
hidrolizan a la hormona de manera que su efecto es suave y de poca duración.
Auxinas sintéticas
Son
auxinas sintéticas del ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4
diclorofenoxiacético y ácido indolbutírico (AIB). La primera y la tercera
hormona forman parte de los productos que se utilizan como enrizadores.
Los
tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de
auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos
tumorales. Para el cultivo de callosidades se usan de 0.1 a 5.0 mg/l de AIAy
para la diferenciación de órganos se ha señalado a menudo que es necesario
reducir la concentración de la auxina. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D
para la inducción de la organizacióncelular. Si se usa 2,4-D en muchas especies
de plantas trendrán la tendencia a la formación de callos, por lo que si se
desea inducir la formación de órganos, se necesita cambiar el 2,4-D por otra
auxina como el AIA o bien bajar la conentración.
Citocininas
Citocininas
naturales son:
Zetina
que se extrae del endospermo del maíz y 6 issopentanil adenina (2iP) que se
aisla de Clostridium Tumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los
tejidos. Algunos tipos de tejidos requieren esencialmente citocininas,
principalmente en el fenómeno de la organogénesis; por ejemplo, los callos de
soya o de la médula de tabaco (var Wisconsin #38). Sin embargo, no todos los
tejidos requieren citocininas, aunque algunas crecen bien en su presencia,
éstas no son esenciales.
Citocininas
sintéticas son: 6-benciladenina (6 BA) o también conocida como
bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) también conocida como 6-furfiril
aminopurina (FAP). La 6-benciladenina se utiliza en concentraciones de 1.01-1.0
mg/l. También se emplea la zeatina o isopentil adenina como sustancias de
naturaleza citocinética.
Acido giberélico
El
ácido giberélico no se usa conúnmente para el cultivo de callo. En ocasiones se
adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es común su uso.
Acidos
nucleicos y compuestos con base de ácidos nucleicos
El
ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ERN
estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del
ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas.
El
uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos
de zanahoria. Sin embargo, la cinetina y el extracto de zanahoria, que tiene
actividad de citocinina, tienen el efecto de estimular el crecimiento cuando se
usan con una mezcla de aminoácidos. Por otro lado, la guanina, timina y citosina
inducen la formación de organos en tejidos de tabaco. La mezcla de una
citocinina y ácido orótico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago
índica.
Substancias naturales
Las
substancias naturales de las plantas ampliamente usadas son: de agua de coco
(10-20%), extractos de levadura (EL) y se emplea en concentraciones de
0.01-0.05%, caseína hidrolizada (CH) se emplea desde 0.01% a 1.0% y extracto de
malta (EM) que se adiciona desde 0.1 –0.5% también se usa peptona, jugo de
tomate, pepino, del endospermo inmaduro de maíz y ácido casaamino.
Estas
sustancias son por lo general, termoestables. La adición del endospermo
inmaduro de coco a los medios nutrimentales promueve el crecimiento de tejidos
de diversas plantas. Cuando se usa extracto de levadura se debe tener cuidado
en las diferentes calidades de los extractos, ya que de estos depende la
certeza de los datos. En el caso del ácido casaamino, el efecto de éste podrá
definir si es por hidrólisis ácida por descomposición enzimática. De las
sustancias naturales de plantas, se analizó el agua de coco. Las sustencias
efectivas son estables y se les dividió en relación a sus principales
componentes, en tres fracciones; mezca de aminoácidos y amidas; mío inositol y
d-sorbitol en la fracción neutral y la difenil urea y leuco antocianina en la
fracción activa, las cuales a su vez están unidas por carbones activos. El
efecto del agua de coco es el resultado total de estos tres. Sin embargo, el
agua de coco es una mezcla muy compleja cuyos componentes y concentraciones son
muy variables, dependiendo de la estación del año y sitio de la colecta. Del
endospermo inmaduro de maíz se aislan la zeatina, una de las citocininas, que puede ser un
acelerador en el endospermo. La actividad de esta citoocinina también se
encuentra en semillas inmaduras de lupino, en extracto de levadura y agua de
coco.
Agar
El agar es
un gel que se extrae de algas marinas y que por sus características físicas se
emplea para solidificar el medio básico, cuando ses trabaja con cultivo
estsacionario sólido o semi-sólido. Un buen agar es aquel que:
a. Hierve a 100 °C y que solidifica a
45 °C, aproximadamente. Esta característica le confiere estabilidad a cualquier
temperatura de incubación.
b. No es digerido por enzimas
vegetales.
c. No reacciona con los constituyentes
del medio de cultivo
Hay diferentes
grados o tipos
de agares y
generalmente se le considera como buen soporte del inóculo;
sin embargo, datos proporcionados por compañías elaboradoras de agar comercial
consignan que contiene pequeñas cantidades de tiamina, biotina y minerales, por
lo que no es conveniente utilizarlo indiscriminadamente. Al respecto, White
(1953) sugirió que el agar tiene un papel mutrimental, de tal manera que aporta
y los tejidos son capaces de utilizar.
Romberger
y Tabor (1971) consideraron que mientras sea menos puro, se pueden encontrar
iones, polisacáridos sulfanatados, ácidos grasos de cadena larga, que son
capaces de inhibir el crecimiento bacteriano, pero que aún se desconoce que efecto
puede inducir en tejidos vegetales. Existen indicios que el vigor y peso seco
se incrementa cuando se usa Difco agar purificado, comparativamente al empleo
de Difco Noble agar o Difco bacto agar, éste produce resultados intermedios. De
acuerdo a Debergh (1983), el agar puede contener Ca, Mg, K y Na (cuadros 1-6 y
1-7) de manera que se altera la formulación nutrimental del medio de cultivo.
Es posible que para el caso de la micropropagación comercial no sea requerido
el agar altamente purificado y de esa forma abaten los costos. La concentración
de agar en los medios de cultivo sólidos es variable y depende de la calidad ,
pero usualmente es de 0.7-1.5%. Los medios que tienen altas concentraciones de
sales requieren de un porcentaje alto de agar. Dependiendo de la concentración
del agar y el pH, será la dureza del medio. Cuando el medios es duro, el
crecimiento del inóculo se hace muy lento. Por otro lado, diversos estudios
señalan que concentraciones menores de 1 gL⁻¹, de agar es determinante para
inducir vitrificación (formación de hojas suculentas y frágiles) durante la
fase II de la micropropagación.
Merck
ha elaborado gelrite (phytagel), que a pesar de ser más caro que el agar agar,
tienen la ventaja de emplearse en cantidades menores (0.5 - 2.0g), lo que ha
motivado que muchos laboratorios lo estan usando. Además, tiene la
característica de que al enfriarse es transparente, aspecto importante para la
observación del inóculo, durante la micropropagación.
Existen
otras opciones de agentes solidificantes, pero algunos por sus características
físicas, no endurecen o hierven a las temperaturas que se requieren para su
empleo en el cultivo de tejidos, por ejemplo: La gelatina tiene su punto de
ebullición a 25°C, aproximadamente. Para el caso del cultivo de protoplastos,
algunos autores han empleado alginatos que aunque tiene las ventajas de formar
gel cuando se adiciona o se licua por la presencia de algún agente quelante o
citrato de sodio. Presenta desventajas, como ser altamente termoinestable con
los cationes bivalentes, ocasionado una eliminación de nutrientes (Button y
Botha, 1975).
Sin
embargo, Sigma sabiendo que el agar puede tener algún efecto sobre el
crecimiento del tejido in vitro, ha desarrollado diferentes tipos de agentes
solidificantes buscando proporcionar un mayor número de opciones que se adapten
a las necesidades del investigador, investigaciones o especies vegetales. Estos
productos se caracterizan por tener diferentes grados de pureza y costos,
importantes factores en cualquier investigación u operación de producción.
literatura citada
puche a., f. y rodriguez p., l. 2000. curso-taller
cultivo de tejidos vegetales. ita-25-dgeta. mexico. 152p
15/02/12
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